2021重点实验室年度报告

序号	项目来源	项目编号	项目名称	主持人	经费（万元）
1	国家自然科学基金面上项目	32171610	长期低剂量镉暴露通过肝脏雌激素受体介导线粒体自噬的机制	李汛	59
2	国家自然科学基金地区科学基金项目	32160230	靶向促黏多肽R-Peptide对iPSCs来源肝脏类器官培养体系的优化及机制研究	姚佳	36
3	国家自然科学基金地区科学基金项目	32160255	肠源性胆道微生物结构和功能多样性与复发性胆管结石的成石机制研究	林延延	35
4	科技部高端外国专家引智项目	G2021175001L	西北高发肿瘤防治新技术转化学科创新引智项目	李汛	40
5	兰州市产学研合作成果转化基地		兰州市5G+人工智能辅助消化系统早癌筛查及早诊早治基地	李汛	20
6	甘肃省重点人才项目	甘组通字[2021]17号	基于胰腺疾病发病关键机制研究及临床早诊早治的新技术推广和人才培养	周文策	65
7	甘肃省科技厅一般项目	21JR7RA369	重金属元素在肝癌肠道微生态中的作用及其机理研究	张磊	6
8	甘肃省科技厅一般项目	21JR7RA354	慢性萎缩性胃炎的微生物群落特性及其在疾病逆转中的作用机制研究	白仲添	6
9	甘肃省科技厅一般项目	21JR1RA072	胞外囊泡介导的肝星状细胞与肝癌细胞间的通讯促进肿瘤的Warburg效应	任龙飞	3
10	甘肃省科技厅一般项目	21JR7RA359	基于JAK2-STAT3信号通路探讨芦可替尼对胆囊癌细胞增殖凋亡的影响	王芳红	6
11	甘肃省科技厅一般项目	21JR7RA368	多媒体健康教育对外科手术患者的影响：一项基于循证医学证据的临床研究及预警模型构建	杨丽平	6
12	甘肃省科技厅青年基金	21JR1RA099	胆囊癌类器官的建立及在化疗药物筛选中的应用	徐浩	2
13	甘肃省科技厅重点项目	21JR1RA113	p16ink4a通过Wnt-CCNB1-p53信号途径抑制胰腺癌侵袭能力的分子机制	张辉	3
14	甘肃省自然科学基金	2021-0405-JCC-1426	早期胃癌外泌体miRNA及多组学标记物预测模型构建及应用评估	朱晓亮	6
15	甘肃省卫生健康行业科研项目	GSWSQN2021-001	RNA结合蛋白通过结合并介导UBC剪接调控胆管癌细胞周期的机制研究	孟文勃	20
16	甘肃省中医药科研课题	GZKP-2020-28	桦木酸通过介导miRNA-365调控IL-6/AKT/STAT3信号通路对胰腺癌的影响及其机制	周文策	3
17	甘肃省省级重点人才项目	20JR10RA676	革兰氏阴性杆菌影响胆管结石成分导致结石复发的机制研究	岳平	3
18	兰州市科技局科技发展指导性计划项目	2020-ZD-69	iPSCs来源肝脏类器官培养体系的改进及其在肝脏原位移植中的应用	姚佳	20
19	甘肃省教育厅创新能力提升项目	2021B-006	内源性二氧化硫在脓毒性休克大鼠中枢血压调控中的作用及其机制的研究	李斌	3
20	甘肃省教育厅创新能力提升项目	2021B-013	公民逝世后器官捐献供肝保护及功能评估临床研究	马健	3
21	甘肃省卫生行业计划项目	GSWSHL2021-019	四位一体健康科普模式在甘肃省包虫病防治宣传中的应用	徐丹	1
22	中央高校优秀青年支持计划项目	lzujbky-2021-ey06	PCID2通过调节胞内蛋白琥珀酰化促进肝癌生长的机制	白仲添	80
23	中央高校重点研究基地建设项目	lzujbky-2021-kb37	甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室	王海平	10
24	院内基金优秀博士科研启动基金	ldyyyn2021-119	sCLU在胆管癌*********************	孟文勃	20
25	院内基金学科交叉项目	ldyyyn2021-102	甘肃省结肠癌筛*********************	严俊	12
26	院内基金临床基础研究项目	ldyyyn2020-03	YARS调控CASP******	朱晓亮	10
27	院内基金临床基础研究项目	ldyyyn2020-39	加速康复外科在肝癌切******	甄海燕	2
28	院内基金青年基金	ldyyyn2020-82	健康素养与肝包虫病术******	王海平	3
29	院内基金青年基金	ldyyyn2020-54	UBR5对胃癌患者生******	丁方回	4
30	院内基金青年基金	ldyyyn2020-64	基于NLR及PLR对******	任彦先	4
31	院内基金青年基金	ldyyyn2020-73	术中超声在肝癌切除术******	倪海旭	4
32	院内基金青年基金	ldyyyn2020-87	术前口服盐酸达克罗宁******	马燕妮	2
33	院内基金青年基金应用转化类项目	ldyyyn2020-102	胆汁CLU用于胆管癌******	林延延	5
34	院内基金特别专项基金	ldyyyn2020-107	金纳米棒与诱导性多能******	齐阔	12
35	院内基金管理项目	ldyyyn2021-129	临床研究型患*********************	张靓则	1
36	院内基金管理项目	ldyyyn2021-128	院级生物样本*********************	于海颖	1
37	院内基金管理项目	ldyyyn2021-130	精准健康科普模*********************	李佳佳	1
38	院内基金优秀博士科研启动基金	ldyyyn2021-117	CYP2E1依赖的氧化*********************	任程晖	5
39	院内基金青年基金	ldyyyn2021-61	肝内胆管细胞*********************	赵振杰	6
40	院内基金青年基金	ldyyyn2021-68	肝内胆管癌类器*********************	骆伟	4
41	院内基金青年基金	ldyyyn2021-78	胆管结石复发与*********************	叶诚	3
42	院内基金重点研究专项	ldyyyn2021-28	JAK1/2抑制剂芦可*********************	王芳红	3

3. 2021年在研科研项目

2021年在研科研项目共44项。

获批年度	项目来源	项目编号	项目名称	主持人	经费（万元）
2020	国家自然科学基金地区科学基金项目	82060119	基于iPSCs生物人工肝反应器的构建与评估	李汛	34
2020	国家自然科学基金地区科学基金项目	82060551	sCLU通过CDC25A诱导胆管癌化疗耐药机制及其作为联合治疗靶点的潜在价值研究	孟文勃	34
2020	国家自然科学基金地区科学基金项目	82060666	靶向PCID2阻滞DCTPP1介导的肝癌细胞DNA合成的作用机制及查尔酮类化合物优化	白仲添	34
2020	国家自然科学基金地区科学基金项目	32060289	东大沟工业污染区镉铅砷复合暴露对居民肠道菌群及代谢特征的影响研究	严俊	35
2020	甘肃省委组织部陇原青年创新创业团队项目	甘组通字[2020]9号	5G+人工智能在消化系统肿瘤早筛及早诊早治中的应用研究	李汛	50
2020	甘肃省国际科技合作专项	2020-0204-GHC-0060	ERCP机械模拟器在外科内镜培训中的应用研究及附件研发	孟文勃	16
2020	甘肃省科技厅自然科学基金	20JR10FA692	肥胖与肠道微生态的交互效应在胃癌发生发展中的作用及机制研究	苗龙	3
2020	甘肃省科技厅自然科学基金	20JR10FA699	基于重金属暴露-肠道菌群-代谢轴研究东大沟工业污染区镉铅砷复合暴露对居民的影响	严俊	3
2020	甘肃省科技厅自然科学基金	20JR10FA676	革兰阴性杆菌与胆管结石成分的关系及导致结石复发的机制研究	岳平	3
2020	甘肃省科技厅自然科学基金	20JR5RA368	间充质干细胞治疗实验性自身免疫性肠炎的细胞生物学机制	雒扬	10
2020	甘肃省科技厅省青年科技基金计划	20JR10FA703	内源性PD-1通过调控rpS6促进胆管癌细胞增殖的机制研究	张金铎	2
2020	甘肃省卫健委计划项目	GSWSKY2020-21	PTBL技术在复杂胆道结石中的临床应用研究	张辉	2
2020	甘肃省卫健委计划项目	GSWSKY2020-11	sCLU通过周期调节蛋白诱导胆管癌化疗耐药机制及其作为联合治疗靶点的潜在价值研究	林延延	3
2020	甘肃省教育厅创新能力提升项目	2020B-006	镉暴露致肝细胞毒性的单细胞质谱流式技术解析	任龙飞	5
2020	甘肃省教育厅高等学校创新基金项目	2020B-005	MXRA7通过EMT促进甲状腺乳头状癌转移的机制研究	张恒玮	15
2020	兰州市科技局人才创新创业	2020-RC-45	p16ink4a通过Wnt-CCNB1-p53信号途径抑制胰腺癌侵袭能力的分子机制	张辉	10
2020	兰州市科技局新冠专项	2020-XG-44	兰州市COVID-19流行期流感样病例与大气环境的关系研究及其预测模型的建立	严俊	1
2020	兰州市科技局	2020-XG-47	青蒿素抵抗SARS-Cov-2免疫细胞炎症反应的机制	雒扬	1
2020	兰州市城关区科技局新冠专项	2020JSCX0019	人脐带血间充质干细胞治疗2019-nCoV冠状病毒感染患者的临床疗效及维持肠道菌群稳态作用的研究	李汛	15
2020	兰州市城关区科技局社会发展类	2020-2-11-2	肝癌患者TACE术后肠道微生物功能及结构多样性相关研究	张磊	10
2020	兰州市城关区科技局科技计划项目	2020JSCX0043	胆总管结石复发机制及预防的临床关键技术研究	岳平	8
2020	院内基金优秀博士科研启动基金	ldyyyn2019-03	iPSCs来********	姚佳	20
2020	院内基金学科交叉	ldyyyn2019-75	TACE对********	张磊	10
2020	院内基金临床研究（应用类）	ldyyyn2019-69	白蛋白结合型********	芮少珍	6
2020	院内基金临床研究（基础类）	ldyyyn2019-50	巨噬细胞来源********	王正峰	4
2020	院内基金青年基金	ldyyyn2019-97	应用NBI********	柴长鹏	4
2020	院内基金临床研究（基础类）	dyyyn2019-20	胆管癌来源********	岳平	3
2020	院内基金青年基金	ldyyyn2019-105	公民逝世后器********	马健	3
2020	院内基金青年基金	ldyyyn2019-108	门诊患者肠道********	王芳昭	1.5
2020	院内基金临床研究（基础类）	ldyyyn2019-45	OCIAD2在胰腺癌中的表达及其机制研究	董春逯	3
2020	兰州大学中央高校基本科研业务费	lzujbky-2020-kb05	多梳蛋白PCGF2和PCGF4在调控胆管癌细胞侵袭能力及维持胆管癌干细胞中的作用	胡进静	1
2019	兰州市科技局	2019-4-9	兰州大学-中源协和干细胞生物工程股份有限公司细胞医学转化联合实验室	李汛	25
2019	中央高校校长专项基金项目	lzujbky-2019-sp09	胆道疾病可视内镜诊断图谱	李汛	4
2018	兰州市人才创新创业项目	2017-RC-37	胆道结石复发与上消化道微生态关系研究	周文策	40
2019	陇原青年创新创业人才项目（省委组织部）	甘组通字[2019] 39号	胆管癌胆汁肿瘤标记物筛查验证及机制研究	孟文勃	40
2019	兰州市城关区科技局科技计划项目	2019RCCX0038	内源性PD-1通过rpS6调控下游分子乙酰化促进胆管癌细胞增殖的机制研究	孟文勃	10
2019	国家自然科学基金地区基金项目	31960236	高原环境对人体肠道微生物多样性的影响及其机理研究	张磊	39
2019	兰州市科技局人才创新创业项目	2019-RC-34	肠道微生物调节胆汁酸代谢在肝硬化进展中的作用机制研究	张磊	20
2019	国家自然科学基金地区基金项目	81960516	循环肿瘤细胞lncRNA FOXP4-AS1在胰腺癌复发转移中的功能及机制研究	朱克祥	34
2019	国家自然科学基金地区基金项目	81960293	atRA通过NaCl-SGK1-IL-23R信号稳定Treg抵抗高盐炎性修饰治疗EAE的免疫学机制研究	雒扬	36
2019	甘肃省陇原创新创业人才项目	甘组通字[2019]39号	FO抑制肝癌细胞侵袭的靶点筛选及机制	白仲添	6
2019	兰州市城关区科技局科技计划项目	2019JSCX0092	胆汁中Clu对胆管癌的临床诊断价值及其机制研究	林延延	9
2019	甘肃省卫建委卫生行业科研管理项目	GSWSKY-2019-104	解郁安眠洗方对消化系统肿瘤患者围手术期睡眠影响的临床研究	蒲小金	3
2019	兰大一院院内基金学科交叉项目	ldyyyn2018-29	PCID2调节肝癌细胞增殖的机制及分子靶向药物筛选	白仲添	15

4. 2021年结题科研项目

2021年结题科研项目共11项。

序号	项目来源	项目编号	项目名称	主持人	经费（万元）
1	甘肃省科技重大专项建设计划	1602FKDA001	细胞精准治疗甘肃重大及高发慢病的医学转化体系建立	李汛	300
2	甘肃省科技创新服务平台	18JR2TA018	甘肃省重大疾病临床及生物信息资源库	李汛	50
3	甘肃省省级引导科技创新发展专项资金竞争性项目	甘财科[2018]32号	互联网+内镜大数据信息及远程医疗共享平台	李汛	200
4	兰州市人才创新创业项目	2016-RC-57	NRP1对肝癌侵袭能力的影响及分子机制研究	李汛	30
5	甘肃省科技重大专项	20ZD2FA001	甘肃省新型冠状病毒感染联防联控体系建设	李汛	1000
6	甘肃省科技厅重点研发-新冠专项	20YF2FA008	新冠病毒感染的基础与临床转化研究	李汛	100
7	兰州市城关区科技局新冠专项	2020JSCX0019	人脐带血间充质干细胞治疗2019-nCoV冠状病毒感染患者的临床疗效及维持肠道菌群稳态作用的研究	李汛	15
8	甘肃省重点研发计划	20YF2FA001	基于新冠等突发公共卫生事件科研攻关的紧急应对及响应机制研究	孟文勃	25
9	甘肃省卫生行业计划	GSWSKY2017-26	甘肃省上消化道早癌筛查、诊治及早癌标记物筛选	朱晓亮	3
10	兰州大学服务甘肃省经济社会发展专项研究项目	0411181424	甘肃省早期胃癌高危人群筛查及标记物筛选	朱晓亮	16
11	甘肃省青年科技基金计划	18JR3RA360	肝星状细胞内一维磁性纳米结构的作用机制的高分辨电子显微研究	齐阔	3

5. 2021年论文发表

2021年发表科研论文63篇，其中SCI论文36篇（一区文章5篇，二区文章12篇），国家级核心期刊论文27篇。

序号	文章信息	刊物级别	分区	影响因子
1	Zhang Y, Jing Y, Wang Y, Tang J, Zhu X, Jin WL, Wang Y, Yuan W, Li X, Li X. NAT10 promotes gastric cancer metastasis via N4-acetylated COL5A1. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 3;6(1):173.	SCI	一区	17.278
2	Zhang L, Ma XJ, Fei YY, Han HT, Xu J, Cheng L, Li X*. Stem cell therapy in liver regeneration: Focus on mesenchymal stem cells and induced pluripotent stem cells. Pharmacol Ther. 2021 Sep 28:108004.	SCI	一区	12.310
3	Li CX#, Gao J#, Zhang Z, Chen L, Li X, Zhou M, Wheelock ÅM*. Multiomics integration-based molecular characterizations of COVID-19. Brief Bioinform. 2021 Dec 2:bbab485.	SCI	一区	11.62
4	Xia B#, Yang M#, Nguyen LH, He Q, Zhen J, Yu Y, Di M, Qin X, Lu K, Kuo ZC, He Y, Zhang C, Meng W, Yuan J*. Regular Use of Proton Pump Inhibitor and the Risk of Inflammatory Bowel Disease: Pooled Analysis of 3 Prospective Cohorts. Gastroenterology. 2021 Dec;161(6):1842-1852.e10.	SCI	一区	22.682
5	Yang M, He Q, Gao F, Nirantharakumar K, Veenith T, Qin X, Page AT, Wong MCS, Huang J, Kuo ZC, Xia B, Zhang C, He Y, Meng W, Yuan J, Pan Y*. Regular use of proton-pump inhibitors and risk of stroke: a population-based cohort study and meta-analysis of randomized-controlled trials. BMC Med. 2021 Dec 3;19(1):316.	SCI	一区	8.775
6	Lu F#, Ma X-J-N#, Jin W-L, Luo Y and Li X* (2021) Neoantigen Specific T Cells Derived From T Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for the Treatment of Hepatocellular Carcinoma: Potential and Challenges. Front. Immunol. 12:690565.	SCI	二区	7.561
7	Mi N#, Huang J#, Huang C#, Lin Y#, He Q, Wang H, Yang M, Lu Y, Lawer AL, Yue P, Bai B, Zhang J, Zhang C, Cai T, Fu W, Gao L, Li X, Yuan J, Meng W*. High serum uric acid may associate with the increased risk of colorectal cancer in females: A prospective cohort study. Int J Cancer. 2022 Jan 15;150(2):263-272.	SCI	二区	7.396
8	Honglong Zhang#, Jun Yan#, Jingping Niu, Haiping Wang, Xun Li*, Association between lead and cadmium co-exposure and systemic immune inflammation in residents living near a mining and smelting area in NW China, Chemosphere, Volume 287, Part 3, 2022, 132190	SCI	二区	7.086
9	Xie Y, Yao J, Jin W, Ren L and Li X* (2021) Induction and Maturation of Hepatocyte-Like Cells In Vitro: Focus on Technological Advances and Challenges. Front. Cell Dev. Biol. 9:765980.	SCI	二区	6.684
10	Yao J#, Yang M#, Atteh L, Liu P, Mao Y, Meng W, Li X*. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell Int. 2021 Jul 27;21(1):398.	SCI	二区	5.722
11	Y. Zhou#, J. Hu#, L. Liu, M. Yan, Q. Zhang, X. Song, Y. Lin, D. Zhu, Y. Wei, Z. Fu, L. Hu, Y. Chen, X. Li*, Gly-tRF enhances LCSC-like properties and promotes HCC cells migration by targeting NDFIP2, Cancer Cell International 21(1) (2021) 502.	SCI	二区	5.722
12	Jiang W#, Li X#, Dong S, Zhou W*. Betulinic acid in the treatment of tumour diseases: Application and research progress. Biomed Pharmacother. 2021 Oct;142:111990.	SCI	二区	6.53
13	Dong S, Li X, Jiang W, Chen Z, Zhou W*. Current understanding of ferroptosis in the progression and treatment of pancreatic cancer. Cancer Cell Int. 2021 Sep 9;21(1):480.	SCI	二区	5.722
14	Xu H, Miao X, Li X, Chen H, Zhang B, Zhou W*. LncRNA SNHG16 contributes to tumor progression via the miR-302b-3p/SLC2A4 axis in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Cell Int. 2021 Jan 12;21(1):51.	SCI	二区	5.722
15	Li X, Xu H, Yi J, Dong C, Zhang H, Wang Z, Miao L, Zhou W*. miR-365 secreted from M2 Macrophage-derived extracellular vesicles promotes pancreatic ductal adenocarcinoma progression through the BTG2/FAK/AKT axis. J Cell Mol Med. 2021 May;25(10):4671-4683.	SCI	二区	5.31
16	Yan J#, Zhang H#, Niu J, Luo B, Wang H, Tian M, Li X*. Effects of lead and cadmium co-exposure on liver function in residents near a mining and smelting area in northwestern China. Environ Geochem Health. 2022 Jan 17.	SCI	二区	4.609
17	Tian M#, Yan J#, Zhang H, Wei Y, Zhang M, Rao Z, Zhang M, Wang H, Wang Y, Li X*. Screening and validation of biomarkers for cadmium-induced liver injury based on targeted bile acid metabolomics. Environ Pollut. 2022 May 1;300:118837.	SCI	二区	8.071
18	Song XJ, Zhang L, Li Q, Li Y, Ding FH, Li X*. hUCB-MSC derived exosomal miR-124 promotes rat liver regeneration after partial hepatectomy via downregulating Foxg1. Life Sci. 2021 Jan 15;265:118821.	SCI	三区	3.6
19	Zhang H#, Yan J#, Xie Y, Chang X, Li J, Ren C, Zhu J, Ren L, Qi K, Bai Z, Li X*. Dual role of cadmium in rat liver: inducing liver injury and inhibiting the progression of early liver cancer. Toxicol Lett. 2021 Nov 13:S0378-4274(21)00879-1.	SCI	二区	4.372
20	Ren, C.; Ren, L.; Yan, J.; Bai, Z.; Zhang, L.; Zhang, H.; Xie, Y.; Li, X.*, Cadmium causes hepatopathy by changing the status of DNA methylation in the metabolic pathway. Toxicology Letters 2021, 340, 101-113.	SCI	二区	4.372
21	Lin YY, Wang YD, Yue P, Zhang XZ, Leung JW, Jiao PP, Yang M, Wang HP, Bai B, Liu Y, Zhang JD, Chen HB, Meng WB*, Li X. Could saline irrigation clear all residual common bile duct stones after lithotripsy? A self-controlled prospective cohort study. World J Gastroenterol. 2021 Jan 28;27(4):358-370.	SCI	三区	5.742
22	Zhang L#, Pu K#, Liu X, Bae SDW, Nguyen R, Bai S, Li Y, Qiao L*. The Application of Induced Pluripotent Stem Cells Against Liver Diseases: An Update and a Review. Front Med (Lausanne). 2021 Jul 1;8:644594.	SCI	三区	5.091
23	Luo Q#, Zhang H#, Wang H, Ma L, Huang M, Niu J, Luo B, Yan J*, Li X. The Effects of Lead and Cadmium Co-exposure on Serum Ions in Residents Living Near a Mining and Smelting Area in Northwest China. Biol Trace Elem Res. 2021 Oct 28.	SCI	三区	3.738
24	Ma J, Xue H, He LH, Wang LY, Wang XJ, Li X, Zhang L. The Role and Mechanism of Autophagy in Pancreatic Cancer: An Update Review. Cancer Manag Res. 2021 Nov 2;13:8231-8240.	SCI	三区	3.989
25	Li X, Jiang W, Gan Y, Zhou W*. The Application of Exosomal MicroRNAs in the Treatment of Pancreatic Cancer and Its Research Progress. Pancreas. 2021 Jan 1;50(1):12-16.	SCI	三区	3.327
26	Li TY#, Chen ZX#, Wang YD, Liu Y, Zhang JD, Yue P, Meng WB*. A novel endoscopic retrograde cholangiopancreatography technique to reduce stone size in type IV Mirizzi syndrome: avoiding cholangiojejunostomy. Chin Med J (Engl). 2021 Jan 19;134(8):1004-1005.	SCI	三区	2.628
27	Li X, Yan M, Chen J, Luo Y. The Potential of Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Cytokine Storm due to COVID-19. Biomed Res Int. 2021 Nov 26;2021:3178796.	SCI	三区	3.411
28	Li X*, Zhou Y, Hu J, Bai Z, Meng W, Zhang L, Song X, Wei Y, Yan J, Zhou Y. Loss of neuropilin1 inhibits liver cancer stem cells population and blocks metastasis in hepatocellular carcinoma via epithelial-mesenchymal transition. Neoplasma. 2021 Mar;68(2):325-333.	SCI	四区	2.575
29	Li X, Liu S, Xu H, Zhou W*. Curative Effect and Safety of Tolvaptan Combined With Traditional Diuretics in Treatment of Patients With Cirrhotic Ascites and Relevant Research on Its Dose. Am J Ther. 2021 Jan 4;Publish Ahead of Print.	SCI	四区	2.688
30	Xu H, Li X, Zhu KX, Zhou WC*. Ectopic opening of the common bile duct into the duodenal bulb with recurrent choledocholithiasis: A case report. World J Clin Cases. 2021 Jul 6;9(19):5332-5338.	SCI	四区	1.337
31	Ren C, Ren L, Yan J, Bai Z, Zhang L, Zhang H, Xie Y, Li X*. Transcription profiling of cadmium-exposed livers reveals alteration of lipid metabolism and predisposition to hepatic steatosis. Xenobiotica. 2021 Nov;51(11):1271-1281.	SCI	四区	1.908
32	Ma R, Zhao M, Zou X, Zhou J, Bai Z*. MicroRNA polymorphism: A target for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma? Oncol Lett. 2021 Apr;21(4):324.	SCI	四区	2.967
33	Ma B#, Li J#, Yang WK, Zhang MG, Xie XD, Bai ZT. N-trans-Feruloyloctopamine Wakes Up BBC3, DDIT3, CDKN1A, and NOXA Signals to Accelerate HCC Cell Apoptosis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021 May 22;2021:1560307.	SCI	四区	2.916
34	Zeng Chao, Zhang Hengwei*, Mechanisms of actin-binding protein transgelin-2 in tumorigenesis, Discovery Medicine, Published on July 23, 2021	SCI	四区	2.97
35	Wang YP*, Wei T, Ma X, Zhu XL, Ren LF, Zhang L, Ding FH, Li X, Wang HP, Bai ZT, Zhu KX, Miao L, Yan J, Zhou WC, Meng WB, Liu YQ. Effect of Helicobacter Pylori on Plasma Metabolic Phenotype in Patients With Gastric Cancer. Cancer Control. 2021 Jan-Dec;28:10732748211041881.	SCI	四区	1.99
36	T. Zhou#, J. Wu#, Y. Zeng#, J. Li#, J. Yan, W. Meng, H. Han, F. Feng, J. He, S. Zhao, P. Zhou, Y. Wu, Y. Yang, R. Han, W. Jin, X. Li, Y. Yang, X. Li*, SARS-CoV-2 triggered oxidative stress and abnormal energy metabolism in gut microbiota, MedComm 3(1) (2022) e112.	SCI
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6. 2021年专利授权

序号	专利名称	专利号	发明人	专利权人	授权公告日	专利类型
1	一种竖直板恒流式生物人工肝反应器	ZL 2020 1 0675158.4	李汛；严孟超；严俊	兰州大学第一医院	2021.3.16	发明专利
2	一种具有消炎利单功效用于治疗胆囊炎和胆汁淤积的中药组合物	ZL 2019 1 0084433.2	李汛;魏玉辉;秦红岩;武新安;张磊;张帆;张国强;靳永文;王利军	兰州大学第一医院	2021.6.1	发明专利
3	一种专用于ERCP术后残余胆管结石、粘液和絮状物的清理装置	ZL 2020 1 1507810.8	孟文勃；林延延	兰州大学第一医院	2021.11.23	发明专利
4	人PCID2蛋白在制备或筛选抗肿瘤药物中的应用及具有抗肿瘤活性的化合物	ZL2021 1 0364129.0	白仲添；张保新；席莉莉；周建业	兰州大学第一医院	2022.2.18	发明专利
5	一种伞式活检钳	ZL 2020 2 2647568.6	苗龙	兰州大学第一医院	2021.7.30	实用新型
6	一种普外科护理用引流管用收纳挂架	ZL 2020 2 2246089.3	甄海燕	兰州大学第一医院	2021.7.16	实用新型
7	一种便携式加压供氧装置	ZL 2020 2 1156421.0	任钰	兰州大学第一医院	2021.6.15	实用新型
8	一种便携式中药理疗装置	ZL 2020 2 2377978.3	徐欢	兰州大学第一医院	2021.7.6	实用新型
9	一种普外科临床用术后用清洗装置	ZL 2020 2 1567744.9	于海颖	兰州大学第一医院	2021.5.28	实用新型
10	一种ERCP专用工具箱	ZL 2020 2 1580569.7	闫晓雯	兰州大学第一医院	2021.5.28	实用新型
11	一种实时刻录转播传影仪	ZL 2021 2 1155540.9	李汛；王同虎；郝宏斌	兰州大学第一医院	2021.12	实用新型

7. 2021年专著出版

专著名称	作者排序（第几主编/编委）	出版社	出版时间	书号ISBN
外科学	李汛编委	北京：高等教育出版社	2021.9	ISBN978-7-04-056518-8
临床医学导论	李汛编委	北京：人民卫生出版社	2021.5	ISBN978-7-117-31531-9
漫话胆道结石与胆道肿瘤	李汛编委	北京：人民卫生出版社	2021.1	ISBN978-7-117-30967-7
胆囊癌	李汛编委	北京：人民卫生出版社	2021.8	ISBN978-7-117-31900-3

8. 2021年科研获奖

获奖名称	授奖单位	主要完成单位	主要完成人	奖项级别	获奖等级	获奖时间
第七届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛全国总决赛	教育部	兰州大学第一临床医学院	李汛，朱晓亮	国家级	金奖	2021年10月
第七届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛甘肃分赛	甘肃省教育厅	兰州大学第一临床医学院	李汛，朱晓亮	省级	金奖	2021年9月
欧美同学会第二届“双创”大赛	欧美同学会（中国留学人员联谊会）	兰州大学第一医院	姚佳	省级	一等	2021年12月

9. 最新研究进展

研究方向一：干细胞治疗西部高发疾病的基础及临床转化研究

1-1. 新型生物人工肝反应器的构建

肝功能衰竭是由病毒、药物、肝脏恶性疾病以及先天性代谢疾病等多种原因导致肝脏功能急剧或逐渐进入失代偿阶段而出现的复杂临床病症。其中急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭患者可以出现重度黄疸、出血、严重腹水、肺水肿以及肝性昏迷等肝功能衰竭症状，病情危重，死亡率高。现行最佳治疗方式为肝移植，但捐献器官的数量有限，远低于临床需求，因此肝衰竭治疗面临巨大困境。人工肝系统借助体外机械、化学或生物性装置，体外部分替代肝脏功能，清除体内毒性物质，能够帮助肝衰竭患者安全度过肝再生恢复阶段或肝移植等待阶段，为肝衰竭治疗提供新的思路。

理想的生物人工肝应该具有充足的肝细胞来源、成熟的肝细胞功能以及对于肝脏微结构的充分模拟。已有的多种类型的生物型人工肝系统针对以上方面进行不同程度的优化，大致可分为支架型，平板型以及悬浮型等。

图1 筛选合适的水凝胶体系承载肝样细胞。

图2 流体培养系统简图。

本研究筛选合适的水凝胶体系承载肝样细胞以及构建流体培养系统（图1，图2）。通过合成不同机械强度水凝胶并对水凝胶表面进行改性已获得能够支持肝细胞生长的水凝胶载体。研究中制备不同改性方式水凝胶，通过使用肝细胞系BRL-3A对水凝胶黏附性能及细胞毒性进行测试；通过3D打印方式建立水凝胶反应器模型；使用精密蠕动泵系统对水凝胶反应器及种植细胞进行循环培养。

图3 不同水凝胶改性方式对于肝细胞黏附性的影响: A-D分别为原始水凝胶、糖基化蛋白改性、离子改性以及多巴胺改性与大鼠肝细胞BRL-3A共培养黏附测试结果，其中糖基化蛋白改性表现出有效的细胞黏附特性以及较低的细胞毒性。

原始水凝胶合成后具有低黏附特性，不适宜进行贴壁细胞的黏附培养。因此通过对原始水凝胶表面进行适当改性提高水凝胶的细胞黏附性能，将之转换为可黏附凝胶。

现已测试多种机械强度及改性方法水凝胶，包括多巴胺、纤连蛋白及糖基化蛋白等多种改性方式，如图3。经测试，糖基化蛋白物理吸附最佳的黏附性能，同时细胞毒性较低，适合进行反应器制备。此外，对不同刚度水凝胶在培养基中的溶胀特性进行测试，发现低刚度水凝胶容易出现溶胀，导致水凝胶形状及刚度发生改变，因此使用较高刚度水凝胶能够较好的维持水凝胶的形态及力学性能。通过测试细胞黏附性能及细胞毒性筛选获得适宜黏附性及刚度水凝胶的制备方法。

团队以改善肝细胞来源和细胞培养方式为主要着眼点设计了新型人工肝反应器系统，即竖置板恒流式生物人工肝反应器。该反应器结合iPSCs肝向分化技术，共培养技术以及流体细胞培养技术，拟进一步提高肝细胞在体外的代谢解毒功能。目前该技术已得到国家发明专利授权，相关研究工作正逐步推进。

1-2. 干细胞来源肝样细胞的培养及肝脏类器官培养体系的建立

干细胞来源的肝样细胞（Hepatocyte-like cells, HLCs）细胞移植技术在肝脏疾病治疗及肝脏再生领域动物实验研究，取得了较好的试验结果。然而干细胞诱导得到HLCs细胞移植技术有重大安全隐患，相较于正常肝细胞，HLCs分化程度较低且存在潜在成瘤风险，很大程度上限制了其临床应用。肝脏类器官（liver organoid, iPSCs-liver bud, LO）培养模式的出现，为干细胞疗法的应用提供了新的契机。然而，体外诱导得到的HLCs始终不能具备完整肝细胞功能及基因表型的原因。类器官正是模拟了这一发育过程，将内皮细胞-间充质细胞-肝胚细胞(ECs+ MCHs+ HLCs)在特殊的培养条件下共培养，使其在抗黏附基质表面通过自发聚集的方式，形成肝脏胚芽组织，既肝脏类器官。经过类器官(LO)培养后，HLCs分化成为LO-HLCs，其细胞分化程度更高，肝细胞功能更加全面。相较于HLCs，LO在肝脏细胞/器官移植治疗方式中有明显优势：1）类器官培养后LO-HLCs分化程度更高，功能及表型更接近肝细胞；2）类器官移植后能够迅速实现血管生成，成活率高；3）类器官易于定植，移植细胞不易扩散至其他器官。尽管如此，类器官相较于正常肝组织，仍不具备完全的生理功能，如蛋白分泌、血氨转化等，其基因表型亦有差异。近年来，为培养得到细胞分化程度更高LO-HLCs，较多研究组针对肝脏类器官的培养体系进行了调整和探索，主要思路为去除培养基质中的各种细胞因子，促进细胞自发聚集成为分化程度较高的类器官。

肝脏类器官培养体系仍处于不断改进过程中，改进思路为保留支撑功能的同时去细胞因子以降低基质黏附能力，从而排除基质的干扰使得细胞间能够更好地自发聚集和组装。但伴随着类器官发育过程中培养基质黏附功能及促黏附因子的去除，细胞之间的黏附及细胞因子调控也受到了某种程度的影响，导致LO-HLCs分化程度始终不理想，成为类器官技术进一步发展的瓶颈。如何在不影响细胞自发聚集组装的情况下，增强细胞间的黏附及信息交流，是实现肝脏类器官获得正常肝脏生理功能的必要途径。我们设想，一种安全稳定的小分子物质，能够进入细胞间隙，同时激活α5β1和Sdc4膜受体，促进细胞间黏附和交流，又不阻碍其自发聚集组装等活动，是解决类器官培养瓶颈问题的有效方案。本研究组通过改进肝脏类器官培养体系，加强肝脏类器官培养体系中细胞间黏附及信息交流程度，与抗黏附基质联合培养得到肝脏类器官，检测新培养体系得到的肝脏类器官功能及相关基因表型，考量其作为肝脏器官移植供体的潜能。

图1 MSCs体外诱导分化得到HLCs。

图2 类器官的培养体系的建立。

图3 类器官的染色和鉴定。

图4 HLCs类器官培养前后对比。

1-3. 炎性微环境对hiPSC来源的类肝细胞增殖及功能影响的实验研究

人诱导多能干细胞来源的类肝细胞是肝细胞移植及生物人工肝的理想细胞来源，不仅能实现体外的大量培养及扩增，而且iPSC能够从患者自身诱导而来，避免了免疫排斥和伦理问题。但在应用肝细胞治疗或者生物人工肝时，移植的肝细胞或生物反应器中的肝细胞直接或间接地与患者的血清接触，血清中的有毒成分可能影响到细胞的活性和功能，导致类肝细胞治疗晚期肝病疗效并不理想。

本研究建立稳定的体外诱导类肝细胞的分化及维持体系，并进行表型和功能的鉴定。采用hiPSCs作为类肝细胞的来源，细胞状态稳定后，在matrigel基质胶上完成类肝细胞的分化实验。首先类肝细胞的诱导一共分为3各阶段：内胚层阶段、肝前体细胞和类肝细胞，采用细胞因子诱导的方法，分布将hiPSC诱导成为类肝细胞。通过形态学、CK18、AFP、ALB、HNF4α、CYP3A4等表达的PCR检测及ALB和AFP的免疫荧光等评估类肝细胞表型及诱导效率。使用体外诱导的类肝细胞作为原肝细胞的替代，在生物人工肝和肝细胞移植治疗终末期肝病的应用中表现出巨大的前景。但终末期肝病血清微环境对移植细胞及生物人工肝中的基础细胞的影响，目前还没有明确的结论。因此本研究利用乙肝肝硬化终末期肝病病人的血清模拟体内血清微环境，探索类肝细胞在接触到疾病血清后的表型和功能变化。

第一部分：体外诱导类肝细胞形成，最开始采用商业试剂盒初步探索诱导体系，细胞在诱导结束后出现典型的上皮细胞的形态，但受限于诱导体系，无法形成大量用于实验的细胞数量，因此转而采用混合细胞因子诱导法，试图通过一定比例的细胞因子混合液体，在体外形成类肝细胞细胞，并通过细胞形态、基因表达、蛋白表达等评估类肝细胞的表型和功能。

图1 细胞因子诱导法诱导hiPSC，分化12天时进行传代实验，左图为传代前，右图为传代后。可以看到传代前后细胞的形态变化不大，但是增殖速率减慢。

图2 肝祖细胞分化阶段细胞基因的表达情况，右图表明细胞的分化后代表多能性的OCT4表达降低，而肝细胞表达基因升高。左图表明在HPC分化阶段，肝特异基因的表达都有不同程度的升高。

第二部分：收集乙肝肝硬化终末期患者血清和急性肝衰竭患者血清，通过抽取全血并分离血清，使用商业化细胞因子测定试剂盒，测定血清中的IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，INF-γ等细胞因子。通过样本匹配的方式，收取健康对照组的血清，进行对比。发现血清中具有统计学差异的细胞因子，但由于样本量过少，因此还需要继续补充样本量，重新测定。

图3 血清中个细胞因子的浓度测定。分别对比了健康组，慢性肝衰竭和急性肝衰竭患者血清中IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，INF-γ的含量。

结果表明，来源于iPSC的类肝细胞在形态上类似于肝细胞的上皮形态，并且PCR结果中呈现出肝细胞基因AFP，ALB等的表达，但是在免疫荧光实验中，仅观察到部分AFP的表达，ALB几乎不表达，由此可见细胞蛋白表达的功能存在一定的缺陷，仍然属于未成熟肝细胞。并且在细胞进行传代后，出现大量的细胞凋亡和无法增殖，细胞形态也出现了很大的变化，由此可见该细胞因子诱导方法该存在一定的问题。

团队还重点总结了体外诱导类肝细胞方法的最新进展和当前挑战，当前在体外形成类肝细胞的细胞来源和技术方法以及促进体外类肝细胞成熟技术的重点难点，并讨论了类肝细胞在治疗终末期肝病和成为基础研究新平台等方面的最新进展，对类肝细胞目前的诱导方法和未来趋势提出了见解和思考。发表于Frontiers in Cell and Developmental Biology。

图4 促进 HLC 体外成熟的不同方法以及 HLC 形成的各种细胞来源。 ESCs，胚胎干细胞； iPCSs，诱导多能干细胞；MSCs，间充质干细胞； HpSCs，肝干细胞； HGF，肝细胞生长因子； bFGF，碱性成纤维细胞生长因子。

1-4. 肝细胞癌中TIL重编程的iPSC及其再分化为T细胞体系的构建与功能评估

免疫治疗是继手术治疗、化疗、放射性治疗之后治疗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的方法之一。目前，以TIL为代表的过继疗法已经在一些实体瘤的治疗中取得了良好的效果。但是，制备理想的细胞实际上是困难的，因为TIL中的主要细胞群通常会表现出一种耗竭的状态。iPSC是使用外源重编程因子从体细胞产生的多能干细胞，其中T细胞是iPSC生成的一个有趣的细胞来源，因为亲本T细胞的T细胞受体（TCR, T cell receptor）重排模式可以传递给T细胞衍生的iPSC （T-iPSC）。同样地，从T-iPSC再生的T细胞保留了相同的TCR信息和抗原特异性。另外，iPSC同其他干细胞相同，具有在体外无限增殖的能力，因此理论上，iPSC技术可以无限供应抗原特异性CD8+ T细胞，并且从T-iPSC再生T细胞的这些优势对传统的 TIL-ACT面临的问题具有一定程度的改善。IL-12不仅可以直接作用于免疫系统促进免疫活化，还能够诱导血管内皮细胞上调表达内皮粘附分子对引导T淋巴细胞浸润至肿瘤组织具有促进作用，故本研究拟构建人IL-12基因载体，并将其在再生T细胞中进行表达，进一步对其作用于肿瘤局部而非全身的功能进行探究。

研究内容包括：（1）在HCC中，通过对患者肿瘤组织来源的TIL进行分离、培养，并进一步利用诱导多能干细胞技术对其进行重编程得到TIL-iPSC，再将TIL-iPSC进一步诱导分化为T细胞。通过对重编程前后的T细胞的杀伤能力、扩增能力、表型、端粒长度及线粒体功能和数量进行对比分析后，对iPSC技术改善TIL-ATC疗法的治疗潜力作以评估；（2）构建表达人 IL-12 基因的 PiggyBac转座子载体,在电转下,将携载IL-12基因的转座子系统导入状态良好的TIL-iPSC-T获得持续稳定表达，通过TIL-iPSC-T细胞表型分析及体外功能实验研究探讨TIL-iPSC-T细胞携载IL-12基因的有效性和可行性，为HCC的免疫疗法提供新思路。

研究方法主要包括：（1）文献调查与分析；（2）细胞分离、培养与鉴定；（3）T细胞功能实验；（4）细胞重编程；（5）T细胞的诱导分化与成熟；（6）IL-12过表达载体的构建；（7）T细胞的电转。

图1 探索并建立了HCC来源的TIL细胞的分离与培养方法与培养体系，成功培养5例HCC来源的TIL细胞。通过MACs人肿瘤组织解离试剂盒和MACS 组织处理器的结合处理，将收集的HCC组织解离为单细胞悬液。采用密度梯度离心法后，将分离所得的淋巴细胞进行培养。如图所示为11号HCC样本来源的TIL分别在40×（A）、100×（B）、200×（C）、400×（D）镜下的细胞形态图，图中红色框线标记位置为TIL中同一T细胞团聚集生长图。

图2 分别对同一HCC患者外周血与组织中T细胞比例进行流式分析。外周血分离T细胞中CD3+细胞占比为81.5%，其中CD3+CD8+细胞占比为67.8%。TIL中CD3+细胞在40%左右，CD3+CD8+细胞在15%左右。

在重编程过程中，外周血来源的T细胞在第5-6天会出现小簇克隆（4个细胞以上的克隆团块形成），但是TIL无克隆形成，也未出现细胞贴壁的现象。分析可能与以下几个因素有关：（1）TIL的活化不够：长期浸润于肿瘤组织的淋巴细胞常处于耗竭状态，需要在分离培养后对其进行激活与刺激；（2）可能与培养基的选择有关：因TIL的耗竭状态，目前所使用的RPMI 1640培养基+10%FBS的培养方式可能对TIL的生长营养需求不够；（3）饲养层细胞培养或无饲养层细胞培养的影响：本实验设计中采取无饲养层细胞培养方式，但饲养层细胞培养可以为目的细胞生存提供物理空间支持，分泌目的细胞所需生长因子，可能无饲养层细胞培养方式提供营养不足。基于以上因素，接下来需进一步优化实验方案，改善重编程体系。

本课题的成功实施将可以在肝细胞癌免疫治疗中开发新的过继细胞疗法，相比于传统ACT疗法，TIL-iPSC来源的T细胞有望提高肿瘤杀伤效率与提高T细胞在体内的存活率。可以在将来应用于一些不具备接受手术切除条件、术前应用缩小癌肿、术后应用清除零星病灶以及转移癌等患者。这种新的过继细胞疗法与传统HCC治疗方法的优化组合，可以让更多患者在不久的将来受益。

团队在本课题进行的同时，关注和重点阐述了目前间充质干细胞和诱导多能干细胞在肝再生中研究的应用和进展，并总结了肝再生及间充质干细胞在肝再生中的作用机制和诱导多能干细胞来源的类器官在肝再生中的应用前景，同时对它们在肝再生中存在的技术瓶颈及未来应用趋势提出了见解与思考，发表于Pharmacology & Therapeutics。并分析比较近15年在iPSC领域以及TCR-T细胞疗法中全世界研究者们的最新科研成果，发表于Frontiers in Immunology。

图3 间充质干细胞和诱导多能干细胞在肝再生中的最新研究进展。

图4 结合iPSC技术下的肝癌免疫治疗。

1-5. 人脐带间充质干细胞对自身免疫性肝炎的作用机制

自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis, AIH）是一种免疫介导的无明确病因的炎症性肝病，患病人群涉及所有年龄、性别和种族。AIH大多隐袭性起病，临床症状及体征各异，可进展至肝纤维化、肝硬化、肝衰竭死亡或肝移植。目前，泼尼松龙单药治疗或联合巯唑嘌呤已经被欧洲肝病学会（European Association for the Study of the Liver, EASL）推荐为AIH治疗的一线方案。然而大量临床研究表明，此方案虽然能明显缓解症状，延缓病情进展并提高生存率，但是患者复发率高，副作用大。常见的不良反应包括库欣综合征、继发性糖尿病及骨质疏松等。所以AIH迫切需要寻找一种新的治疗方式。

间充质干细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）是一种具有自我更新和多向分化的成纤维样细胞。由于MSCs低表达主要组织相容性复合体Ⅰ，不表达主要组织相容性复合体Ⅱ，其具有优势之一：低免疫原性，且 MSCs 无论是起源不同（异体或者自体）或者来源不同（骨髓、脂肪组织或者脐带）都有低免疫原性, 可以发挥其免疫调节作用并逃避免疫排斥, 从而可以在人类白细胞抗原不匹配环境中应用。优势之二：MSCs具有免疫调节的特点，可通过细胞间接触或外分泌物在炎症环境中对多种免疫细胞发挥免疫抑制作用，且已经在多种自身免疫性疾病中取得了较为成功的基础实验，clinical trial 上注册了上千个MSCs针对难治性疾病和免疫性疾病的临床试验，MSCs成为具有潜力的治疗方式之一。

大量事实证明：MSCs治疗自身免疫性肝炎是可行的且可以不断改进提高疗效，本项目的立意即出自此处，利用S100蛋白构建AIH小鼠模型，然后将hMSC注入AIH小鼠体内，观测其治疗效果并对其中的机制进行探究。

本研究首先进行人干细胞肺分离鉴定及AIH动物模型的构建。然后研究了hMSC治疗AIH小鼠的表型及细胞亚群改变：首先将小鼠随机区组化分为正常组、模型组，hMSC治疗组 ①检测并比较各组小鼠体重、肝脾指数、生化指标、肝脏病理评分等改变。②质谱流式分析肝脏脾脏中免疫细胞的亚型变化。③PCR和western blot分析肝脏分子和蛋白水平变化。之后进行了hMSC发挥作用的机制研究。

图1 一般指标：A．实验流程图。B.正常组、AIH组、MSC治疗组脾脏大体观。C.正常组、AIH组、MSC治疗组脾指数（脾指数=脾重/总体重）。D.脾指数与病理评分的相关性。E. 正常组、AIH组、MSC治疗组肝指数（肝指数=肝重/总体重）。F/G.正常组、AIH组、MSC治疗组血清ALT、AST、ALB、GLO、TP变化。

图2 肝脏病理：正常组、AIH组、MSC治疗组肝脏病理knodell-HAI评分；肝脏HE染色，免疫荧光观察免疫细胞浸润。

图3 脾脏流式：流式细胞仪分析脾脏中th1、th17、treg细胞的变化。

图4 质谱流式预实验：质谱流式细胞仪分析模型组和MSC治疗组脾脏中免疫细胞的变化。

经本次实验主要证明了人间充质干细胞对实验性自身免疫性肝炎有一定改善，其可以降低肝脏的炎症评分，减少肝脏炎症细胞的浸润，而且通过本次实验，发现肝脏炎症程度与肝脾指数呈现出显著的线性关系，综上，本次实验为临床试验的应用提供了更可靠的证据。可以看出，hMSC可以改善AIH小鼠的一般指标、生化指标、肝脏炎细胞浸润减少，肝脏病理炎症评分下降，脾脏炎症细胞下降。然而hMSC治疗AIH仍然存在诸多问题：1）本实验中，采用的S100模型存在模型一致性不强特点，有的小鼠可以出现腹水，有的小鼠比正常小鼠炎症重一些，模型的先天特点和个人技术操作导致对小鼠数量要求比较多。所以此模型的一致性有待于提高改进。2）hMSC至今仍没有一个较为统一的行业标准，2006年细胞治疗学会对MSC表面标记物、三系分化、贴壁成纤维样成长做了最低规定，然而MSC由于取材宿主不同、操作者技术熟练程度、培养代次不同等还是存在很大异质性。3）hMSC在体内的命运结局不清晰，目前我们是采用的实验流程无法观测MSC在体内的长期疗效。4）hMSC发挥的机制不明：hMSC被报道具有免疫调节能力，但是在AIH中具体通过哪个机制发挥作用，仍然有待探索。

1-6. hUCB-MSC 来源的外泌体促进大鼠部分肝切除术后肝再生的实验研究

hUCB-MSC 是一类具有分泌生物活性物质能力的细胞，可减轻组织损伤，维持细胞的生长活力等作用。之前的研究指出，它主要利用定向分化的方式来进行肝细胞的补充，或者是受趋化因子作用从而发生迁移逐渐到达相关的损伤部位，然后进行抗凋亡及促增殖细胞因子的分泌，由此起到作用。然而，近年来越来越多的数据表明：MSCs 在组织修复中的作用机制可能更倾向外分泌调节性的细胞因子来改变组织微环境发挥作用。

本研究以hUCB-MSC为研究对象，首先在新鲜脐带组织中利用组织块培养法分离培养出hUCB-MSC。采用流式细胞术等技术鉴定成功后，采用无血性低葡萄糖的LG-DMEM培养基提取细胞培养液，采用超速离心的方法来进行了外泌体的提取，通过TEM、NAT系统进行外泌体形态学表征及粒径分析，并利用Western Blot检测外泌体表面CD63、CD9等表面标记蛋白。分别用70%大鼠肝切除模型及大鼠缺血再灌注损伤模型在体内验证hUCB-MSC来源的外泌体促进部分肝切除术后肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。又利用一系列的在线工具开展生物信息学靶基因的相关预测，预测miR-124的主要潜在靶点，通过大量的反复对比和验证，依靠预测结果来推测实验目标的内在原因，最后结合模型动物及大鼠BRL-3A细胞系，利用qPCR、Western Blot等方法判断预测准确性。，分析靶miRNA的下游信号通路及潜在的相互作用网络。

研究结果讨论分析如下：

图1 采用组织块法培养 hucMSCs。

图2 流式细胞技术检测 hucMSCs。

（1）镜下观察提取、培养得到的hUCB-MSC细胞呈梭形，纺锤状，细胞形态均匀。流式细胞技术对靶细胞进行定量分析和分选，显示CD73-FITC（99.49%）和CD105-PE（99.88%）呈现阳性表达；HLA-DR-PE和CD45-FITC表达呈现阴性，各自对应于0.26%和0.38%的表达率。

（2）通过超速离心发现所提取的hUCB-MSC来源的外泌体通过电子显微分析之后，主要有椭圆或者是圆形的外部特征，且尺寸不一，膜结构较为完整，其中还存在着一定量的低密度物质；纳米粒子跟踪分析系统显示其粒径大小分布在48-150nm之间；通过筛选外泌体相关的标志性蛋白CD9、CD63，证实了实验中获取的hUCB-MSC来源的外泌体结果稳定、可靠。

（3）hUCB-MSC来源的外泌体可以显著增加SD大鼠70%肝切除术后第2天、第3天的肝体比，测定数值在实验组（PH+exo）、对照组（PH）之间差异明显（P ＜0.05）；hUCB-MSC来源的外泌体可以显著降低缺血再灌注损伤组第2天、第3 天大鼠肝脏组织中SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标水平，实验组（HIRI+exo）与对照组（HIRI）之间差异明显（P＜0.05）。

（4）采用MicroRNA微阵列分析发现经过hUCB-MSC来源的外泌体干预后实验组（PH+exo组）较对照组（PH组）肝脏组织中miR-193a、miR-124和miR-93在外泌体治疗后显著上调，而miR-204和miR-10a-5p呈下调趋势。采用qPCR方法分析了miR-193a、miR-204、miR-124、miR-365、miR-93、miR-16、miR-10a-5p、miR-32等在PH+exo组与PH组中的相对表达情况，进一步发现miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在两组中的表达存在差异，其中miR-124在两组中的表达存在显著差异（P＜0.01）。通过qPCR分析miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在hUCB-MSC来源的外泌体中的相对表达量，发现外泌体中表达水平高的microRNA分别是miR-193a、miR-124和miR-93。

图3 肝切除后注射外泌体组/未外泌体组 miRNA 微阵列芯片分析结果。

图4 生物信息学在线预测 miR-124 的潜在靶基因。

（5）通过三种生物信息学方面的靶基因预测工具（如TargetScan、DIANA以及miRDB等）对miR-124所对应的潜在靶点进行在线预测，发现了6个常见靶点（Chtf8、Pasp、CHSYS、Adam9、Strbp和Foxg1），进一步通过qPCR、Western Blot、双荧光素酶报告分析系统等进一步证实miR-124与Foxg1的3'-UTR之间的相互作用等验证转录因子Foxg1是miR-124的直接靶点。

图5 AgomiR-124 干预后 3d 肝组织切片 HE 染色结果。

（6）通过western blot分别检测各实验组（PH、PH+exo、PH+antigomiR-124、PH+exo+antigomiR-124、Sham、Sham+exo、Sham+agomiRNA-124等）大鼠肝脏中Foxg1蛋白的表达，反复验证后发现调控miR-124的表达水平后可负向调节Foxg1的表达促进大鼠肝细胞增殖。

研究结论如下：（1）本实验成功分选出hUCB-MSC，成功筛选并验证了hUCB-MSC来源的外泌体所提取的结果稳定、可靠。（2）实验获取的外泌体对实验大鼠在实施了肝切除手术之后的肝再生起到了良好的促进作用，且减轻了SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标，具有一定肝损伤保护作用。（3）采用MicroRNA微阵列技术鉴定出了在hUCB-MSC来源外泌体中差异表达并与肝脏生相关的miR-124，也进一步证明了hUCB-MSC来源的外泌体miR-124对大鼠部分肝切除术后的肝再生有很大的促进作用，并有助于减轻肝细胞损伤。（4）本研究发现转录因子Foxg1是miR-124的直接靶点，后者可对Foxg1表达进行靶向抑制，从而使实验大鼠体内的肝细胞实现快速增殖。

1-7. HSTP1修饰的huc-MSCs来源的外泌体治疗肝纤维化实验研究

肝星状细胞（HSCs）的活化及其分泌细胞外基质（ECM）在肝脏内过度沉积是肝纤维化进展的关键步骤。间充质干细胞（MSC）来源外泌体与母细胞有相似的功能，对活化的肝星状细胞（aHSCs）具有明显的调控作用，被认为是一种安全有效的无细胞试剂。然而，未经修饰的外泌体从外周静脉注入体内，很快被单核细胞吞噬系统清除。

本研究拟通过对噬菌体展示肽库进行生物淘选，获得与aHSCs特异性结合的靶向肽，利用基因工程技术将靶向肽展示在外泌体表面，赋予外泌体靶向转运至aHSCs的能力，提高外泌体抗纤维效果，为临床逆转肝纤维化治疗提供新的策略。

图1 免疫荧光检测HSTP1与HSC-T6结合的特异度，A：激光共聚焦显微镜观察相同浓度的FITC-HSTP1与不同细胞孵育后荧光强度变化。B：Image J软件定量检测相同浓度FITC-HSTP1与HSC-T6孵育后荧光强度。比例尺，20μm。**** P＜0.0001。

图2 组织免疫荧光检测HSTP1与aHSCs结合的特异性，A:肝纤维化和正常肝组织中，检测HSTP1的定位情况，已验证HSTP1与aHSCs结合的特异性。B：肝纤维化组织中，比较HSTP1和rcHSTP1与aHSCs的结合的能力。比例尺，100μm。

图3 不同干预措施后HSC-T6细胞内脂滴的变化，比例尺，20μm。

在这项研究中，我们通过生物淘选技术对噬菌体展示肽库进行筛选，获得与 HSC-T6 细胞特异结合的靶向肽（HSTP1），结果显示HSTP1 在纤维化的肝组织病理切片中对aHSCs同样具有良好的靶向结合能力。随后，我们通过基因工程技术将HSTP1与外泌体膜蛋白（Lamp2b）融合并展示将外泌体表面。结果显示，与空白对照外泌体（Blank-Exos）和Lamp2b过表达外泌体（Lamp2b+Exos）相比，工程化的外泌体（HSTP1-Exos）可以更有效地被 HSC-T6 细胞内吞，从而增强了外泌体促进HSC-T6转化为相对静止的表型的能力。体内研究结果表明，HSTP1-Exos经静脉注射到大鼠体内后可以特异性分布在 aHSCs周围，并且增强了逆转肝纤维化的治疗效果。

研究结论：HSTP1是一种可靠的能与aHSCs特异性结合的靶向肽；HSTP1的修饰提高了huc-MSCs来源的外泌体对aHSCs的靶向性，促进了对aHSCs的活化抑制，提高了外泌体逆转肝纤维化的能力。

研究方向二：西部重大及高发消化系统肿瘤免疫治疗及发病机制与西部环境典型重金属暴露健康效应研究

2-1. 典型环境污染物与健康效应及复合效应研究

2-1-1. 人群研究进展

（1）铅镉联合暴露与全身免疫炎症的关系

镉（Cd）和铅（Pb）广泛应用于工业领域，因其在体内较长的生物半衰期，从而对机体健康造成严重威胁。越来越多的证据表明，与重金属相关的负面影响可能与机体炎症和免疫紊乱有关。近年来，全身免疫炎症指数（SII）、嗜酸性粒细胞-淋巴细胞比（ELR）、淋巴细胞-单核细胞比（LMR）、血小板-淋巴细胞比（PLR）和中性粒细胞-淋巴细胞比率（NLR）被用作全身炎症标志物。基于此，本研究采集了居住在矿冶区附近居民的外周血样本，以全面评估Cd/Pb联合暴露对全身免疫炎症功能的影响。

本研究是来自东大沟-兴隆（DDGXL）队列的一个巢式病例对照研究，共纳入了符合纳入和排除标准的486名受试者（313名女性和173名男性）。采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测血液中Cd（BCd）和Pb（BPb）的水平，并使用血小板计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞计数和嗜碱性粒细胞计数计算得出与全身性免疫炎症相关的生物标志物（ELR、LMR、PLR、NLR、SII）。在调整相关混杂因素后，运用多元线性回归分析单一Cd/Pb暴露水平与免疫炎症生物标志物之间的关联。进一步，根据Cd和Pb的四分位数范围，将所有受试者重新编码为三个新变量：高暴露组、中暴露组、低暴露组，并运用单因素方差分析和Kruskal-Wallis秩和检验分析组间差异，运用多元线性回归分析Cd/Pb联合暴露对免疫炎症生物标志物的影响。

在本研究中，BCd和BPb被用作环境暴露的生物标志物。我们的研究结果表明（见图1），对照地区居民的BCd（四分位距[IQR]：0.080-0.423 μg/L）和BPb（IQR：6.963-20.675 μg/L）水平在正常范围内，这与先前研究报道的中国不同地区普通人群的重金属暴露水平一致。然而，污染地区的BCd（中位数[MED]：2.515 μg/L）和BPb（28.055 μg/L）水平显着高于对照区（P < 0.01），这与上海某工业和生活区的暴露水平相似。因此，本研究选择两地居民作为研究对象，研究长期低剂量Cd和Pb共同暴露对全身免疫炎症的影响是可行的。

图1 血液中镉(Cd)和铅(Pb)的分布。

多项研究均调查了人类暴露于Cd和Pb的全身免疫炎症状态。然而，只有少数研究表明共同暴露对全身免疫炎症的影响。例如，Zhang等人报道了暴露于重金属Pb、Cd、Hg和As的学龄前儿童的免疫细胞和细胞因子的变化。具体而言，促炎因子IL-1β和IL-6增加，而淋巴细胞和抗炎因子IL-1RA和IL-13减少，中性粒细胞计数、IL-1β、IL-6和IL- 1RA与暴露于Pb、Cd、Hg和As显着相关。我们的结果与这些先前的发现一致，但是本研究的创新之处在于，我们的研究指标是根据外周血中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板计数计算得出的一套综合的免疫炎症标志物。我们发现高暴露组的ELR、NLR和SII水平高于中低暴露组（p < 0.05或0.01）。此外，高暴露组受试者的 LMR 水平明显低于低暴露组（p < 0.01）（见表1）。

表1 Cd/Pb联合暴露程度和免疫炎症标志物的关系
	低暴露 (n = 60)	中暴露 (n = 251)	高暴露 (n = 175)	p值
Age (years)				0.456
<50	13(21.7)	57(22.7)	29(16.6)
50-60	28(46.7)	111(44.2)	92(52.6)
>60	19(31.7)	83(33.1)	54(30.9)
BMI				0.082
<24	57(95.0)	223(88.8)	165(94.3)
≥24	3(5.0)	28(11.2)	10(5.7)
ELR	0.036(0.021-0.061)	0.045(0.027-0.076)	0.046(0.030-0.082)*	0.035
NLR	1.502(1.115-1.988)	1.850(1.474-2.389)**	1.900(1.500-2.600)**	<0.001
PLR	106.000(86.313-136.761)	113.889(92.917-154.167)	116.000(96.190-149.286)	0.224
LMR	7.500(6.438-9.298)	7.200(5.714-8.800)*	6.400(5.200-8.333)**	<0.001
SII	337.845(247.402-463.750)	425.000(302.417-552.000)**	429.000(320.000-595.400)**	0.002
ELR：嗜酸性粒细胞-淋巴细胞比率；LMR：淋巴细胞-单核细胞比率；PLR：血小板-淋巴细胞比率；NLR：中性粒细胞-淋巴细胞比率；SII：全身免疫炎症指数 * P < 0.05; ** P< 0.01.

本研究首次将这些指标用作Cd和Pb共同暴露后全身免疫炎症的生物标志物。与 Cd 和 Pb 联合低暴露组的受试者相比，我们观察到，对于 Cd 和Pb 共同暴露，并且 NLR 与共同暴露水平的相关性比其他生物标志物最强。这表明重金属暴露引起的全身免疫炎症反应的特点是循环中性粒细胞水平升高，循环淋巴细胞水平降低，NLR可作为 Cd 和 Pb 共暴露引起的全身性免疫炎症的早期生物标志物。

表2 Cd/Pb联合暴露水平与免疫炎症标志物的线性关联
因变量	自变量	模型 1		模型 2
		β (95% CI)	P-int	β (95% CI)	p-int
ELR	LE	reference	0.014	reference	<0.001
	ME	0.325 (0.046 to 0.604)*		0.293 (0.019 to 0.567)*
	HE	0.436 (0.145 to 0.727)**		0.376 (0.089 to 0.662)*
NLR	LE	reference	<0.001	reference	<0.001
	ME	0.519 (0.242 to 0.795)**		0.485 (0.211 to 0.759)**
	HE	0.643 (0.355 to 0.931)**		0.579 (0.292 to 0.865)**
PLR	LE	reference	0.233	reference	0.058
	ME	0.172 (-0.109 to 0.453)		0.201 (-0.079 to 0.482)
	HE	0.253 (-0.040 to 0.546)		0.298 (0.005 to 0.591)*
LMR	LE	reference	<0.001	reference	<0.001
	ME	-0.317 (-0.594 to -0.039)*		-0.267 (-0.537 to 0.002)
	HE	-0.567 (-0.856 to -0.278)**		-0.468 (-0.750 to -0.186)**
SII	LE	reference	0.003	reference	0.025
	ME	0.408 (0.129 to 0.686)**		0.395 (0.115 to 0.675)**
	HE	0.500 (0.210 to 0.790)**		0.482 (0.189 to 0.774)**
模型1未调整任何变量；模型2根据性别、年龄、BMI进行了调整。 Int：交互作用；CI：置信区间；HE：高暴露组；ME：暴露组；LE：低暴露组；ELR：嗜酸性粒细胞-淋巴细胞比率；LMR：淋巴细胞-单核细胞比率；PLR：血小板-淋巴细胞比率；NLR：中性粒细胞-淋巴细胞比值；SII：全身免疫炎症指数。 * P < 0.05; ** P< 0.01.

研究发现，高水平的BCd和BPb会影响居住在有色金属矿冶基地附近的居民的全身免疫炎症状态。我们的数据表明，Cd/Pb联合暴露与全身性免疫炎症有关，并且Cd/Pb联合暴露会以剂量依赖性方式加重免疫炎症反应。此外，免疫炎症生物标志物NLR和LMR，尤其是NLR，可用作评估由Cd/Pb联合暴露引起的全身性免疫炎症的潜在标志物。

（2）铅镉重金属暴露是肝功能异常的危险因素

镉（Cd）和铅（Pb）广泛存在于环境中，并通过食物链或吸烟进入人体。此外，由于缺乏有效的排泄机制，Cd和Pb可以长期在机体中蓄积，从而对肝脏、肾脏和骨骼等不同器官造成不可逆转的损害。研究表明，镉暴露会导致肝脏氧化应激和DNA损伤，从而加重肝脏代谢紊乱和遗传毒性。然而，以前的大多数研究都集中在单一金属暴露的影响上。在许多情况下，镉和铅污染可以在环境中共存，人们可能会同时接触这两种金属。因此，我们旨在本研究旨在探讨Cd/Pb共同暴露对中国西北地区某矿区附近居民肝功能的主要影响和交互作用。

研究人群来自东大沟-兴隆（DDGXL）队列，该队列自2015年成立以来，一直致力于重金属污染地区的环境监测和居民健康管理。本研究共纳入了451名受试者，使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测量了血镉（BCd）和血铅（BPb）的浓度，采用本中心的自动化学分析仪测量了与肝功能相关的指标（ALT、AST、CHE、GGT、ALP、TBil、IBil、DBil、TBA）。运用相关性分析和多元线性回归分析了单一Cd/Pb暴露与肝功能指标水平之间的关联；进一步，使用BCd和BPb水平的四分位数范围重新生成5个新的变量：高Cd和Pb组、单一高Cd组、单一高Pb组、中Cd和/或Pb组、低Cd和Pb组，使用多元线性回归模型和logistic回归模型评估了肝功能异常与BCd和BPb水平以及Cd/Pb联合暴露之间的关系。

在临床中，某些肝酶（如：ALT、AST）已被用作诊断肝细胞损伤的生物标志物。Richard等人报告了暴露于水泥的工人的血清ALT和AST含量高于正常范围。我们的结果与先前的报道一致。如表1所示，与对照地区相比，污染地区人群的血清AST、ALT、GGT和CHE水平显着升高（p < 0.01）。此外，生活在污染地区的参与者的BCd和BPb水平显着高于生活在对照地区的参与者（p < 0.001），提示Cd或Pb暴露对肝功能有破坏作用，是肝功能异常的危险因素。

表1 非污染区和污染区受试者的肝功能指标、镉和铅水平
	非污染区 (n = 133)	污染区 (n = 318)	p 值
肝功能指标
AST (U/L)	22.40 (18.90‒27.80)	24.40 (20.60‒29.35)	0.008*
ALT (U/L)	19.20 (15.05‒25.40)	22.75 (17.58‒31.15)	< 0.001*
TBil (umol/L)	17.30 (14.30‒21.20)	16.80 (13.40‒21.80)	0.462
DBil (umol/L)	6.30 (5.55‒7.50)	5.90 (4.50‒7.10)	< 0.001*
IBil (umol/L)	11.10 (8.95‒14.15)	11.20 (8.50‒14.83)	0.811
ALP (U/L)	86.00 (70.50‒106.00)	91.50 (77.75‒109.00)	0.059
GGT (U/L)	14.00 (12.00‒19.50)	19.00 (14.00‒30.00)	< 0.001*
CHE (KU/L)	8.12 (7.17‒9.31)	9.15 (8.10‒10.17)	< 0.001*
TBA (umol/L)	1.80 (1.20‒3.00)	1.90 (1.50‒2.73)	0.323
有毒微量元素
BCd (ug/L)	0.08 (0.08‒0.14)	2.45 (0.20‒5.42)	< 0.001*
BPb (ug/L)	12.90 (6.51‒19.56)	27.71 (17.18‒43.27)	< 0.001*
BMI：体质指数；AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶；TBil：总胆红素；DBil：直接胆红素；IBil：间接胆红素；ALP：碱性磷酸酶；GGT：谷氨酰转肽酶；CHE：胆碱酯酶；TBA：总胆汁酸；BCd：血镉；BPb：血铅。 *p < 0.05.

在环境中，人们更多同时接触两种或多种重金属，因此，众多学者已经对重金属联合暴露的肝毒性机制进行了许多工作。长期以来，氧化应激一直是镉和铅引起的肝损伤的关键机制。虽然Cd和Pb是非氧化还原金属，但它们会诱导活性氧（ROS）的过度产生和抗氧化酶的减少，破坏氧化和抗氧化防御之间的平衡，从而导致氧自由基的积累，促进细胞氧化损伤。与暴露于单一金属的大鼠相比，暴露于Cd和Pb混合物的大鼠肝脏中两种金属的积累减少更多，并且单一Cd处理可能对氧化应激产生更深远的影响，这表明Cd和Pb可能发挥作用在诱导肝脏氧化应激中的拮抗作用。我们的研究得出了一致的结果。如表2所示，调整混杂因素后，在单一高Cd暴露的受试者中，BCd水平与AST、ALT和CHE水平之间的关联性最强。此外，我们采用logistic回归模型分析了与Cd/Pb联合暴露相关的肝功能异常风险（表3）。在调整性别和/或其他混杂因素后，与低Cd和Pb暴露组的受试者相比，中Cd和/或Pb组、单一高Cd组、单一高Pb组和高Cd和Pb组的受试者患肝功能异常的风险[OR (95% CI)]分别为11.900 (1.573 - 90.044)、16.673 (1.944 - 139.438)、9.163 (1.004 - 83.616) 和 9.447 (1.132 - 78.870)，表明单一高Cd组患肝功能异常的风险最高。

表2 镉和铅对肝功能指标的相互作用
β(95% CI)	非污染区	污染区					p-int
β(95% CI)	非污染区	Low Cd&Pb	Moderate Cd&Pb	High Cd	High Pb	High Cd&Pb	p-int
AST	Reference	0.283 (-0.092‒0.658)	0.283 (0.052‒0.515)*	0.423 (0.088‒0.758)*	0.153 (-0.182‒0.488)	0.180 (-0.197‒0.558)	0.242
ALT	Reference	0.347 (-0.020‒0.715)	0.342 (0.115‒0.569)**	0.407 (0.078‒0.736)*	0.248 (-0.081‒0.823)	0.355 (-0.015‒0.853)	< 0.001
TBil	Reference	0.454 (0.088‒0.820)*	-0.039 (-0.265‒0.187)	-0.198 (-0.265‒0.187)	-0.463 (-0.790 to -0.135)**	-0.364 (-0.733‒0.005)	< 0.001
DBil	Reference	0.192 (-0.164‒0.547)	-0.418 (-0.638 to -0.199)**	-0.322 (-0.641 to -0.004)*	-0.842 (-1.160 to -0.524)**	-0.769 (-1.127 to -0.411)**	< 0.001
IBil	Reference	0.362 (-0.008‒0.732)	-0.028 (-0.257‒0.201)	-0.258 (-0.589‒0.073)	-0.373 (-0.704 to -0.042)*	-0.243 (-0.616‒0.130)	0.007
ALP	Reference	0.336 (-0.027‒0.699)	0.225 (0.000‒0.449)	0.242 (-0.083‒0.567)	0.059 (-0.266‒0.384)	0.449 (0.083‒0.815)*	< 0.001
GGT	Reference	0.615 (0.207‒0.959)**	0.480 (0.267‒0.693)**	0.610 (0.302‒0.918)**	0.567 (0.259‒0.875)**	0.716 (0.369‒1.063)**	< 0.001
CHE	Reference	0.411 (0.053‒0.769)*	0.470 (0.248‒0.691)**	0.536 (0.216‒0.857)**	0.532 (0.212‒0.852)**	0.368 (0.008‒0.729)*	< 0.001
TBA	Reference	-0.152 (-0.522‒0.219)	0.044 (-0.185‒0.273)	0.081 (-0.251‒0.412)	0.160 (-0.172‒0.491)	0.329 (-0.044‒0.702)	0.020
根据性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟、饮酒和喝茶的习惯进行了调整。int：相互作用；AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶；TBil：总胆红素；DBil：直接胆红素；IBil：间接胆红素；ALP：碱性磷酸酶；GGT：谷氨酰胺转肽酶；CHE：胆碱酯酶；TBA：总胆汁酸；Cd：镉；Pb：铅。 p < 0.05; *p < 0.01.

表3 镉和/或铅暴露是肝功能异常的危险因素
	模型 1		模型 2
	OR (95% CI)	p value	OR (95% CI)	p 值
BCd (ug/L)
Reference (≤ 1)	1		1
> 1	2.424 (1.272‒4.617)a	0.007**	2.529 (1.288‒4.963)a	0.007**
BPb (ug/L)
Reference (≤ 25)	1		1
> 25	0.525 (0.274‒1.004)b	0.052	0.505 (0.256‒0.996)b	0.049*
BCd and BPb
Reference (Low Cd&Pb)	1		1
Moderate Cd&Pb	11.376 (1.526‒84.787)	0.018*	11.900 (1.573‒90.044)	0.016*
High Cd	17.988 (2.197‒147.297)	0.007**	16.673 (1.944‒139.438)	0.009**
High Pb	7.722 (0.866‒68.846)	0.067	9.163 (1.004‒83.616)	0.050
High Cd&Pb	9.392 (1.148‒76.855)	0.037*	9.447 (1.132‒78.870)	0.038*
两个以上的肝功能指数高于正常范围，或一个肝功能指数至少高于正常范围的两倍，视为肝功能异常。 BCd: 血镉；BPb：血铅。模型1根据性别调整。模型2根据年龄、性别、身体质量指数(BMI)、缺牙、腰围、吸烟、饮酒和饮茶习惯进行了调整。 a: BCd针对BPb和Model1（或模型2）进行调整；b：BPd针对BCd和Model1（或模型2）进行调整。 p < 0.05; *p < 0.01.

高水平的BCd和BPb影响当地居民的肝脏健康。尽管世界各国已经采取了一系列措施来规范重金属污染，但仍需要更多的研究来评估暴露于Cd和Pb对普通人群健康的长期影响。我们的研究得出结论，镉和铅暴露与肝功能受损有关。此外，我们的数据表明，Cd和Pb可能对肝功能有拮抗作用，单独高暴露于Cd可能是肝功能异常的重要危险因素，Pb可能部分抵消Cd在肝脏中的毒性。需要进一步研究Cd和Pb在肝脏中的相互作用以及Cd和Pb共同暴露与肝功能之间的关系。

（3）铅镉联合暴露对居民血清离子的影响

随着现代工业的快速发展，镉、铅等重金属所造成的环境污染正成为一个日益紧迫的问题。长时间的暴露会导致重金属在体内积累，它们的毒性可能会产生长期的有害影响。已有研究证明暴露于镉和或铅可导致一系列疾病，例如骨质疏松症、贫血、肝肾功能受损等。并且已证明，这些疾病与血清离子水平存在关系。基于以上，我们推测镉和铅暴露可能会影响血清中的离子水平。亦有研究证明单独的镉暴露或铅暴露会影响血清离子水平。然而，在自然环境中，铅镉联合暴露是其最常见的存在方式。所以在本研究中，我们检测了居住在矿区附近的居民的血液中镉、铅水平以及血清离子水平。本研究旨在探讨镉铅联合暴露与血清离子水平的关系，并找出镉和铅引起的疾病的预警指标。

研究区域：本研究包括一个对照区和一个污染区。污染区位于中国西北部的东大沟流域,对照区位于距兴隆山70公里的兴隆山国家级自然保护区。对照区的社会、经济、文化和生活条件与污染区相似。

研究人群：本研究人群来自东大沟-兴隆（DDGXL）队列的病例对照研究。本研究共招募了来自污染区和对照区的503名参与者。排除信息和样本缺失者后，共有445名受试者符合纳入本研究的条件。

样本选择与分析：每个受试者收集10毫升静脉血样本（受试者在采集前禁食8-10小时）。采用电感耦合等离子体质谱法测定BPb和BCd。血清钾、钠、氯、总钙、无机磷、镁、铁离子以及阴离子间隙水平由兰州大学第一医院临床实验室测量。

研究结果如下：表1列出了生活在对照区和污染地区的受试者的人口学信息、BCd和BPb以及血清离子浓度。表2展示了对照组和污染组的受试者的BCd、BPb和血清离子浓度的比较。表3是亚分组中血清离子的比较。表4展示了血清离子与暴露水平之间的相关性。

表1 对照区和污染区的受试者的人口学信息、BCd和BPb以及血清离子浓度
	污染区（N=310）	对照区（N=135）	p
年龄	55.850 ± 7.156	55.520 ± 7.086	0.651
性别比例（男性：女性）	111：199	42：93	0.338
BMI	23.766 ± 3.562	23.226 ± 2.896	0.121
血清钾	4.255 (4.028–4.493)	4.530 (4.300–4.840）	<0.000
血清钠	143 (142–144）	142 (141–144）	0.007
血清氯	104 (102–105）	101 (100–103）	<0.000
血清总钙	2.35 (2.28–2.40）	2.33 (2.26–2.40）	0.147
血清无机磷	1.08 (0.98–1.22）	1.16 (1.05–1.25）	<0.000
血清镁	0.88 (0.84–0.92）	0.88 (0.83–0.93）	0.865
血清铁	19.445 (15.945–24.143）	22.780 (17.330–29.630）	<0.000
阴离子间隙	17 (16–19）	19 (16–20）	<0.000
BCd1	2.505 (0.300–5.425）	0.080 (0.080–0.230）	<0.001*
BPb2	27.715 (17.748-42.633）	12.900 (6.260–19.840）	<0.001*
1 BCd: 血镉水平 (μg/L); 2 BPb: 血铅水平(μg/L); 血清铁以 μmol/L为单位; 其他血清离子以mmol/L为单位. 年龄和 BMI 通过t 检验进行分析，结果以平均值±标准差表示。其他连续数据结果显示为中位数(P25-P75)，并使用Mann-WhitneyU-检验进行比较分析。卡方检验用于比较分析性别比例。 *P是来自于反向比例尺的Cox比例风险回归

表2 血清离子单独与BCd或BPb暴露之间的关系

R(p)

血清钾

血清钠

血清氯

血清总钙

血清无机磷

血清镁

血清铁

阴离子间隙

BCd1

-0.116

(0.014)*

0.059

(0.216)

0.264

(<0.000)*

0.009

(0.846)

-0.129

(0.006)*

-0.004

(0.928)

-0.130

(0.006)*

-0.256

(<0.000)*

BPb2

-0.195

(<0.000)*

0.232

(<0.000)*

0.359

(<0.000)*

-0.039

(0.416)

-0.077

(0.107)

0.018

(0.709)

-0.104

(0.029)*

-0.127

(0.007)*

结果显示为相关系数(R)，对应的p值位于下方

1 BCd: 血镉水平; 2 BPb: 血铅水平.

* p < 0.05表明有显著差异

表3 亚分组中血清离子的比较

高镉 & 铅

(n=31)

高镉

(n=44)

高铅

(n=38)

中镉/铅

(n=165)

低镉 & 铅

(n=32)

对照组(n=135)

年龄

56.29 ± 6.80

55.8 ± 6.60

55.95 ± 6.63

56.37 ± 7.52

52.72 ± 6.47

55.52 ± 7.09

0.193

性别比例（男：女）

13：18

21：23

14：24

54：111

9：23

42：93

0.331

BMI

24.02 ± 3.78

23.32 ± 3.53

22.05 ± 4.32

24.05 ± 3.28

24.72 ± 3.29

23.23 ± 2.90

0.004*

血清钾

4.460

(4.180–4.640)

4.350

(4.070–4.480)

4.230

(4.050–4.380)

4.210

(3.990–4.440)

4.345

(4.100–4.660)

4.530

(4.300–4.840)

<0.000*

血清钠

144

(142–145)

143

(141.25–144)

144

(142.75–145)

143

(142–144)

142

(141–144)

142

(141–144)

0.01*

血清氯

105

(103–105)

104

(102–106)

105

(103.5–106)

104

(102–105)

104

(102–105)

101

(100–103)

<0.000*

血清总钙

2.340

(2.260–2.380)

2.385

(2.330–2.440)

2.325

(2.280–2.390)

2.350

(2.280–2.390)

2.385

(2.280–2.450)

2.330

(2.260–2.400)

0.008*

血清无机磷

1.05

(0.95–1.15)

1.05

(0.92–1.21)

1.15

(0.97–1.23)

1.08

(0.98–1.23)

1.13

(1.05–1.26)

1.16

(1.05–1.25)

0.003*

血清镁

0.88

(0.84–0.90)

0.88

(0.83–0.92)

0.91

(0.87–0.93)

0.87

(0.83–0.91)

0.87

(0.83–0.91)

0.88

(0.83–0.93)

0.18

血清铁

18.56

(13.06–22.37)

20.29

(16.62–28.14)

18.18

(16.16–22.42)

19.06

(14.85–24.01)

22.62

(18.14–27.09)

22.78

(17.33–29.63)

<0.000*

阴离子间隙

(16–18)

(15–18)

(16–19)

(17–19.75)

(16–20)

<0.000*

铁离子结果以μmol/L表示，其他离子结果以mmol/L表示。

年龄和 BMI 通过t 检验进行分析，结果以平均值±标准差表示。其他连续数据结果显示为中位数(P25-P75)，并使用Mann-WhitneyU-检验进行比较分析。卡方检验用于比较分析性别比例。

* p < 0.05表示差异显著。

表4 血清离子与暴露水平之间的相关性

β Coefficients (95% CI)

亚分组

血清钾

血清钠

血清氯

血清总钙

血清无机磷

血清镁

血清铁

阴离子间隙

p-int < 0.000

p-int = 0.018

p-int < 0.000

p-int = 0.006

p-int=0.01

p-int=0.216

p-int<0.000

对照组

高镉& 铅

-0.379

(-0.741 to -0.017)

0.460

(0.081–0.839)*

1.152

(0.805–1.499)*

-0.097

(-0.482–0.287)

-0.606

(-0.992 to -0.221)*

-0.031

(-0.419–0.357)

-0.696

(-1.076 to -0.316)*

-0.671

(-1.042 to -0.300)*

高镉

-0.659

(-0.975 to -0.343)*

0.213

(-0.117–0.543)

0.926

(0.624–1.229)*

0.555

(0.220–0.890)*

-0.450

(-0.786 to -0.114)*

-0.102

(-0.440–0.237)

-0.271

(-0.603–0.060)

-0.579

(-0.903 to -0.256)*

高铅

-0.879

(-1.213 to -0.545)*

0.575

(0.226–0.925)*

1.247

(0.927–1.566)*

-0.075

(-0.430–0.279)

-0.176

(-0.531–0.180)

0.357

(0.000–0.715)*

-0.567

(-0.918 to -0.217)*

-0.701

(-1.043 to -0.359)*

中镉和/或铅

-0.886

(-1.097 to -0.675)*

0.151

(-0.070–0.371)

0.808

(0.606–1.010)*

0.059

(-0.165–0.283)

-0.289

(-0.514 to -0.065)*

-0.101

(-0.327–0.125)

-0.491

(-0.713 to -0.270)*

-0.406

(-0.622 to -0.190)*

低镉& 铅

-0.542

(-0.900 to -0.184)*

0.102

(-0.272–0.477)

0.749

(0.407–1.092)*

0.401

(0.021–0.781)*

-0.163

(-0.544–0.217)

-0.125

(-0.508–0.258)

-0.070

(-0.446–0.305)

-0.157

(-0.523–0.209)

Int: 相互影响; CI: 可信区间.

* p < 0.05 level表示差异显著

讨论分析

① 镉铅联合暴露引起的血清钠、氯的剂量依赖性增加

在我们的研究中，污染组的受试者血清钠含量高于对照组；此外，血清钠水平与BPb呈正相关。研究表明，镉和铅暴露会触发显著的肾细胞凋亡，从而导致肾脏损害。亦有研究表明慢性肾病会导致血清钠水平的逐渐升高。我们的研究结果表示，高Pb组的血清钠水平与BCd和BPb之间的关系强于高Cd和Pb组，这说明Pb可能是导致钠含量升高的主要因素。

此外，我们的数据显示，污染组血清氯水平高于对照组，并显示血清氯与BCd和BPb呈正相关。一项有关日本鹌鹑的研究报告称，暴露于镉会导致其血清氯离子水平显著升高。虽然这项研究的研究对象是动物，但他们的结果与我们的结果是一致的。

肾脏主要调节血清离子水平，如钠、氯和钾，这些离子的滤过发生在肾小球，重吸收位于近端和远端肾小管。因此，鉴于上述镉和铅暴露、肾损害和血清氯之间的关系，我们在研究中观察到的血清氯是升高的。在镉铅联合暴露方面，暴露水平与血清氯离子水平升高呈正相关。血清氯离子水平与高BPb暴露组和高镉铅联合暴露组的关系最强。虽然血清氯离子水平与高BCd组之间的关系略弱，但这可能说明镉暴露会改变铅暴露对血清氯的影响。

② 镉铅联合暴露引起的血清无机磷和铁水平剂量依赖性降低和阴离子间隙降低

我们的研究表明，镉铅联合暴露可导致血清中无机磷水平的下降。来自这两个地区受试者的血清无机磷水平存在显著差异，且BCd与血清无机磷水平呈负相关。多元线性回归分析表明，镉是导致血清无机磷水平下降的主要因素。磷酸盐的调节与钙是息息相关的，并且这两种离子的水平在人体中呈负相关。在我们的研究中，镉铅联合暴露会导致血清钙水平升高，这可能也是血清无机磷水平下降的原因。血清无机磷水平与联合暴露水平呈剂量效应负相关，这提示血清无机磷水平可能表明镉铅联合暴露的程度。

BCd、BPb水平与血清铁相关的。污染组受试者血清铁水平较低，镉和铅暴露与血清铁水平呈负相关。有研究显示，BPb与铁水平呈负相关。亦有其他研究表明，镉暴露可通过竞争性地限制铁的吸收和减少促红细胞生成素的分泌以及导致肾功能损害，从而引起铁的缺乏，从而引起贫血。也有研究报道了铅通过被转运铁吸收的tM转运蛋白所吸收，并通过竞争性抑制来阻断铁的吸收。我们研究中血清铁下降可能是Cd和Pb通过竞争性抑制引起的。

联合暴露水平与血清铁水平之间存在负的剂量-效应关系。此外，在一定程度上，我们的数据表明，镉铅联合暴露可能会调节单独镉暴露引起的血清铁水平的降低（表3）。有研究表明单独或联合镉铅暴露9周后，未成熟雌性大鼠的血清铁水平显著下降，这与我们的结果是一致的。因此镉和铅对血清铁水平的相互作用有待进一步研究。

我们的数据显示，污染区受试者血清中的阴离子间隙低于对照区，血清阴离子间隙与BCd和BPb呈负相关。血清阴离子间隙计算公式为[Na+]−([Cl−]+[HCO3−])=未测量的阴离子−未测量的阳离子。通过这个公式以及我们的研究结果可以认为，血清氯增高水平高于血清钠水平，从而血清阴离子间隙整体是降低的。此外，在联合暴露水平和阴离子间隙之间发现了负的剂量效应关系。我们的数据表明，与高镉暴露相比，高铅暴露后的阴离子间隙降低程度更深。因此，Cd和Pb之间可能在降低血清阴离子间隙中存在校正效应。

③ 镉铅联合暴露引起血清钾水平降低和血清钙水平升高

我们观察到污染组受试者血清钾水平低于对照组，并发现钾与BCd和BPb之间呈负相关。我们的数据还显示，不同强度的镉铅联合暴露可能导致不同水平的血清钾下降。已知Cd暴露会导致肾功能不全和骨质疏松症。此外，低血清钾水平与肾细胞凋亡引起的肾功能受损和骨密度降低有关，其通过参与骨内钙磷代谢，从而影响骨形成和骨吸收。因此，我们在研究中观察到的血清钾水平的下降可能是由于Cd暴露引起的肾功能不全和骨质疏松症导致的。然而，镉铅联合暴露与血清钾之间没有剂量效应关系，中镉/铅组的血清钾水平最低。在高Cd/Pb、高Cd和高Pb组中可以观察到校正效应。因此，镉、铅暴露与血清钾之间相互作用还有待进一步研究。

我们的结果表明，这两个区域的受试者血清钙水平没有出现有统计学意义的差异，血清钙与BCd或BPb之间也没有明显的关系。然而，高Cd、低Cd/Pb组的血清钙水平高于对照组。关于血清钙和Cd/Pb暴露的研究已经报道了铅和钙水平之呈负相关，这可能解释了高Pb组中血清钙水平较低的原因。有研究指出，Cd诱导的细胞损伤伴随着许多细胞蛋白和信号通路中钙的置换，因为这两种离子具有高度相似的物理化学特性。这可能解释了为什么在高镉组中观察到最高的血清钙水平。我们的结果表明，随着联合暴露水平的增加，Cd和Pb的中和效应更加明显。在最低的联合暴露水平下观察到最高的血清钙水平，这表明较低的联合暴露剂量可能会对血清钙有出乎意料的影响。

④ 镉铅联合暴露与血清镁之间没有相关性

BCd或BPb与血清镁水平没有出现有统计学意义的关系。一些研究已经研究了血清镁水平和铅暴露之间的关系。有的研究表明BPb与镁呈正相关，亦有研究表明BPb与镁呈负相关。也有报告说，血镁水平与BPb无关，因为他们的大多数研究参与者显示出镁水平在正常范围内。我们的结果与后者一致。镁的代谢可能受多种因素的干扰，例如金属的吸收、分布和排泄、暴露时间等等，这些都会导致研究结果的差异。所以血清镁与BCd/BPb之间的关系还有待进一步研究。

研究结论：在本研究中，我们研究了BCd、BPb和血清离子水平之间的关系。研究结果表明，Cd和Pb暴露，不论单独或联合暴露，均可影响血清离子水平，并可导致离子紊乱。我们的研究结果进一步加深了我们对Cd-Pb共暴露对血清离子的影响的认识，并可能有助于识别慢性肾病、骨质疏松、贫血等疾病的早期预测因素。我们还建议，地方政府应采取相应行动，防止当地居民出现潜在的健康问题。

2-1-2. 动物研究进展

（1）镉在促进肝损伤发生和抑制早期肝癌进展方面发挥双重作用

镉（Cd）是一种环境毒物，被国际癌症研究机构列为I类致癌物，可导致肝、肾、肺、前列腺和其他器官的损害和癌症。此外，Cd还在体外杀死肿瘤细胞，并发挥潜在的抗癌作用。为了进一步探究Cd的肝毒性和抗肝癌特性的机制，我们同时建立了肝损伤大鼠模型和肝癌大鼠模型，并关注Cd对肝脏线粒体自噬的影响，其是最常见的选择性自噬形式，可特异性降解受损的线粒体并维持线粒体平衡，以探讨线粒体自噬在Cd发挥双重作用的重要作用。

在本研究中，成年雄性大鼠给予不同剂量的CdCl2 连续灌胃12周建立大鼠肝损伤模型和肝癌模型，以研究Cd在大鼠肝脏中的双重作用。通过使用原子吸收分光光度法测定肝脏中的Cd浓度，使用本中心的全自动生化分析仪评估大鼠肝功能变化，使用ELISA试剂盒验证大鼠肝脏的脂质过氧化损伤水平，并进行HE染色、Masson染色和免疫组织化学染色以验证模型建立成功。通过联合应用PCR，western blot，免疫组织化学染色和透射电镜分析共同探究Cd对线粒体自噬的影响，最终检测了PINK1/Parkin的mRNA和蛋白水平以探索Cd影响线粒体自噬的信号通路，从病理水平、转录水平、蛋白水平全方位探讨线粒体自噬及其信号通路在Cd促进肝损伤发生和抑制早期肝癌进展中的重要作用。

线粒体自噬是包裹受损线粒体以形成自噬溶酶体，从而降解线粒体以维持线粒体平衡的机制之一。线粒体自噬受多种自噬相关蛋白的调节，包括LC3和P62。LC3被认为是自噬的标志物。当发生自噬时，细胞质中的LC3I转化为LC3II。因此，LC3II与LC3I的比值常被用作自噬的指标。此外，P62在自噬溶酶体形成过程中与LC3II结合，被自噬溶酶体包裹，最后被溶酶体降解。因此，P62的表达反映了整体降解水平，通常用作自噬通量的指标。我们的结果表明，Cd不仅促进了LC3II的表达，而且在两种模型中都增加了P62的水平，同时降低了TOMM20 的水平。同时免疫组织化学染色显示一致的结果，具有明显的剂量依赖性效应。这表明Cd不仅诱导线粒体自噬，而且破坏了肝脏中的线粒体自噬通量。不仅如此，我们在肝脏超微结构表征过程中检测到线粒体自噬，如图1所示，在肝损伤模型中检测到自噬体和自噬溶酶体，其中Cd暴露组较多，尤其是20 mg/kg组。此外，肝癌模型各组均检测到AP和ASS（图2），其中Cd暴露组较多，尤其是10、20和40 mg/kg组。我们可以清楚地观察到20 mg/kg组中包裹在自噬囊泡中的受损线粒体，即线粒体自噬。本研究发现镉暴露引起组织损伤并阻断线粒体自噬流，表明阻断正常肝组织和恶性肝组织中的线粒体自噬流是镉毒性损伤的潜在机制之一。

图1 肝损伤模型中肝细胞的超微结构

A-F中Cd的浓度分别为0、2.5、5、10、20和40mg/kg。N：细胞核；M：线粒体；RER：粗面内质网；GL：糖原；黄色箭头表示自噬小体；黄色虚线箭头表示自噬溶酶体(ASS)。比例尺：1µm，放大倍数×7,000，(n=3)。

图2 肝癌模型中肝细胞的超微结构

A-F中Cd的浓度分别为0、2.5、5、10、20和40mg/kg。N：细胞核；M：线粒体；RER：粗面内质网；GL：糖原；LD：脂滴；Ly：溶酶体；黄色箭头表示自噬小体(AP)；黄色虚线箭头表示自噬溶酶体(ASS)。比例尺：1µm，放大倍数×7000，(n=3)。

目前，PINK1/Parkin作为介导受损线粒体清除的关键伙伴，是调节线粒体自噬的经典信号通路之一。当线粒体受损时，PINK1会在线粒体外膜上积累以激活Parkin。较高水平的Parkin可以促进线粒体和溶酶体之间的融合，并有助于去除受损的线粒体。我们发现 Cd 暴露在两种模型中均以剂量依赖性方式激活肝脏中PINK1/parkin的表达（如图3）。这些结果表明PINK1/Parkin通路在Cd暴露诱导的线粒体自噬中起重要作用。

图3 Cd通过PINK1/Parkin通路激活线粒体吞噬。

本研究表明，Cd以剂量依赖性方式诱导组织损伤和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。此外，Cd暴露破坏了线粒体自噬通量，阻断线粒体自噬进一步加剧了Cd对正常肝组织和恶性肝组织的毒性，进而导致Cd在诱导肝损伤和抑制早期肝癌进展中的双重作用。这项研究发现阻断线粒体自噬可能是治疗肝癌的潜在方法，这为肝癌的临床研究提供了新的思路，而镉的抗肝癌活性的潜在机制之一可能与肝癌细胞中线粒体自噬的抑制作用比正常肝细胞更严重有关。因此，有必要进一步探索。

（2）基于靶向胆汁酸代谢组学的镉致肝损伤新型生物标志物的筛选及验证

镉是一种有毒重金属，在环境和职业中持续存在。目前已知镉可以进入人体并在肝脏中长期蓄积导致肝损伤，但其相应机制仍不完全清楚，并且缺乏特异性的诊断指标。胆汁酸是在肝脏中合成的机体的一种重要代谢物质，它及其代谢通路的改变在肝病的发生发展中具有重要影响。因此，本研究旨在探讨胆汁酸在镉诱导的肝损伤中的作用，并确定可靠、敏感的生化指标来诊断镉致肝损伤，以期为进一步研究镉暴露的肝损伤机制奠定基础，为今后临床诊治及实验研究提供有效参考。

研究内容和方法如下：

首先是镉致大鼠肝损伤及其与胆汁酸之间的关系研究：

① 揭示大鼠肝脏胆汁酸在镉致肝损伤中的作用：在课题组已建立的0、2.5、5、10、20、40mg/kg 镉致大鼠肝损伤模型基础上，测量大鼠的肝功能指标、肝内镉含量以及肝脏、血清、盲肠内容物和粪便18种胆汁酸。观察镉引起的肝脏胆汁酸的变化情况，并将其中显著变化的胆汁酸和肝损伤指标进行相关性分析，得出镉暴露致大鼠肝损伤与肝脏胆汁酸变化之间的关系。

② 根据肝损伤程度筛选出差异胆汁酸，探讨其是否是早期预测和诊断镉致肝损伤及肝脏镉暴露水平的生物标志物：根据肝损伤程度，将6组大鼠分为对照组，轻度镉致损伤组和重度镉致损伤组，再分别通过PCA模型、OPLS-DA模型分析证明镉致肝损伤组和对照组，轻度损伤组和重度损伤组存在分离，并找出在三组中显著变化的差异胆汁酸，通过ROC分析，确定了这些参数的临界值、AUC、灵敏度和特异性，再将其与肝内镉水平做相关性分析，从而得出可早期预测和诊断镉致肝损伤，反映镉致肝损伤严重程度和肝内镉水平的潜在新生物标志物。

③ 通过研究血清、盲肠内容物、粪便胆汁酸水平与肝脏胆汁酸的关系，进一步筛选简便、可行、适宜的镉致肝损伤检测方法：基于胆汁酸的肠肝循环，对大鼠血清、盲肠内容物和粪便单个胆汁酸浓度和整个胆汁酸谱的变化的分析，找出能最佳反映肝脏中胆汁酸变化的检测方法，及时发现镉致肝损伤。

其次是在镉暴露人群血清中验证筛选出的差异胆汁酸：基于胆汁酸代谢在镉致大鼠肝损伤中的重要作用，通过对课题组前期收集的东大沟兴隆（Dongdagou-Xinglong, DDGXL）队列镉暴露人群的血清进行相关检测，在人群中进行验证，从而将胆汁酸代谢机制更好的应用于临床。

研究结果和讨论分析

① 镉暴露可引起肝脏中胆汁酸淤积和有毒胆汁酸增加，从而导致大鼠肝损伤

本研究结果显示，随着镉暴露剂量的增加，肝脏总胆汁酸（total bile acids，TBAs）也随之增加（图1A-C）。而大量研究表明外界因素引起的肝内胆汁淤积会诱导线粒体功能障碍和活性氧、氮的过度生成，导致有毒胆汁酸在肝内积聚，从而导致肝损伤。因此，本研究结果还显示，肝脏胆汁酸中显著增加的甘氨结合型胆汁酸（glycine-conjugated bile acids,G-CBAs）（GCA、GCDCA、GUDCA、GDCA、GLCA）和牛磺结合型胆汁酸（taurine-conjugated bile acids,T-CBAs）（TUDCA、TDCA、TLCA）与AST、ALT、CHE、HA、LN、PC-III呈正相关，与TC呈负相关,提示 GCA、GCDCA、G/TUDCA、G/TDCA、G/TLCA与肝功能障碍、肝脂肪变性和肝纤维化之间有一定相关关系（（图1D、表1）。从本研究可以看出，GCA、GCDCA、G/TUDCA、G/TDCA、G/TLCA与肝功能障碍和肝纤维化呈正相关，与肝脂肪变性呈负相关。由上述可知，肝脏中胆汁酸淤积和有毒胆汁酸GCA、GCDCA、G/TUDCA、G/TDCA、G/TLCA可诱导镉暴露致大鼠肝损伤。

图1 镉暴露处理后大鼠肝脏中胆汁酸的组成变化。（A）T-CBAs、G-CBAs和UCBAs在肝脏中的比例，（B）T-CBAs、G-CBAs和UCBAs在肝脏中的浓度，（C）TBA的浓度，（D）不同暴露组的单个胆汁酸浓度。数据以中位数和四分位数间距[median（P25-P75）]表示（n=6-8）。与对照组比，* P < 0.05， ** P < 0.01。

表1 肝脏胆汁酸和肝功能、肝脂肪变性和肝纤维化指标的相关性分析

胆汁酸	AST	ALT	CHE	TC	HA	LN	PCIII
CDCA	0.309	0.429**	0.004	–0.205	0.281	0.317	0.156
GCA	0.611**	0,718**	0.559**	–0.358*	0.628**	0.426**	0.280
GCDCA	0.663**	0.762**	0.432**	–0.340*	0.653**	0.599**	0.449**
GUDCA	0.624**	0.677**	0.468**	–0.442**	0.622**	0.567**	0.389*
GDCA	0.619**	0.707**	0.516**	–0.468**	0.679**	0.583**	0.455**
GLCA	0.466**	0.527**	0.350*	–0.281	0.512**	0.440**	0.343*
TCA	0.050	0.081	0.191	0.223	0.000	–0.100	0.048
T-β-MCA	–0.557**	–0.416**	–0.370*	0.492**	–0.608**	–0.432**	–0.498**
TUDCA	0.515**	0.522**	0.532**	–0.512**	0.533**	0.448**	0.427**
TDCA	0.660**	0.667**	0.544**	–0.514**	0.638**	0.517**	0.486**
TLCA	0.639**	0.626**	0.402*	–0.455**	0.660**	0.558**	0.493**

r: Spearman相关性分析

与对照组相比，* P < 0.05， ** P < 0.01。

② 肝脏GUDCA、GLCA、TDCA和TLCA有望成为早期预测和诊断镉致肝损伤及肝脏镉暴露水平的生物标志物

根据肝脏损伤程度将6组大鼠分为对照组、轻度镉致肝损伤组（2.5、5、10 mg/kg）和重度镉致肝损伤组（20、40 mg/kg）。与轻度损伤组相比，重度损伤组大鼠的AST、ALT、HA、LN和PC-III水平显著升高（P < 0.05或0.01）。PCA分析结果显示损伤组和对照组的分离（图2A），在PLS-DA分析中进一步增强，如图2B所示。除此之外，图2D显示了轻度和重度损伤组之间的明显区别。对该模型进行了200次置换检验验证，避免过度拟合，验证图表明原模型是有效的（图2C）。

在本研究中，镉致大鼠肝损伤的GUDCA，GLCA，TDCA和TLCA水平较高（图3A-D）。尽管尚无可作为参考的已建立的镉致肝损伤诊断标记，但本研究中鉴定出的候选生物标记AUC值大于0.8，显示出能够以高灵敏度和特异性将Cd致大鼠肝损伤与健康对照区分开的能力（图4、表2）。除此之外，按照肝损伤程度分组后，GUDCA、GLCA、TDCA和TLCA在对照组，轻度和重度损伤组之间持续升高，且各组之间差异显著，并且GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA分别和肝脏镉浓度呈显著正相关（图5）。因此，这些代谢物可能参与镉致肝损伤早期诊断，严重程度测定以及评估肝脏中镉含量的可能性。

图2 大鼠肝脏 BA 谱的多变量数据分析。（A）PCA 图证明了两组之间的样本分离。 1：对照组； 2：镉致肝损伤组。（B）从对照组和Cd致肝损伤组获得的肝脏 PLS-DA散点图。 1：对照组； 2：镉致肝损伤组。（C）在交叉验证图中重复排列测试 200 次。（D）轻度和重度损伤组大鼠肝脏的 PLS 图。 1：对照组； 2：轻度镉致肝损伤组； 3：重度镉致肝损伤组。

图3 筛选镉致大鼠肝损伤的靶向胆汁酸（n = 38）。（A-D）健康对照组与轻、重度损伤组大鼠肝脏胆汁酸水平变化的对比分析：（A）GUDCA；（B）GLCA；（C）TDCA；（D）TLCA。与对照组相比，* P < 0.05，** P < 0.01。

图4 38只大鼠的GUDCA、GLCA、TDCA 和TLCA的受试者操作特征（ ROC ）曲线。将Cd致大鼠肝损伤与健康对照区分开来的胆汁酸的特异性和敏感性分析。数据表示为接收器工作特性曲线下的面积（AUC）。GUDCA（AUC = 0.899 [0.794，1.000]），GLCA（AUC = 0.910 [0.808，1.000]），TDCA（AUC = 0.979 [0.937，1.000]），TLCA（AUC = 0.954 [ 0.890，1.000]），AST（AUC = 0.935 [0.855，1.000]） ]，ALT（AUC = 0.827 [0.700，0.954]， HA（AUC = 0.825 [0.650，1.000]）），LN（AUC = 0.876 [0.763，0.988]）。P <0.05。

表2 检测镉致大鼠肝损伤的截断值、AUC、灵敏度、特异性、PPV和NPV（n=38）

	截断值	AUC （95%CI）	灵敏度（95%CI）	特异性（95%CI）	PPV （95% CI）	NPV （95% CI）
GUDCA（μg/g）	195.800	0.899（0.794,1.000）	1.000（1.000,1.000）	0.742（0.588,0.896）	0.467（0.214,0.719）	1.000（1.000,1.000）
GLCA（μg/g）	0.703	0.910（0.808,1.000）	0.857（0.598,1.000）	0.871（0.753,0.989）	0.600（0.296,0.904）	0.964（0.900,1.000）
TDCA（μg/g）	0.709	0.979（0.937,1.000）	1.000（1.000,1.000）	0.871（0.753,0.989）	0.636（0.352,0.921）	1.000（1.000,1.000）
TLCA（μg/g）	0.494	0.954（0.890,1.000）	1.000（1.000,1.000）	0.903（0.799,1.000）	0.700（0.416,0.984）	1.000（1.000,1.000）
AST（U/L）	109.800	0.935 （0.855,1.000）	1.000（1.000,1.000）	0.871（0.753,0.989）	0.636（0.352,0.921）	1.000（1.000,1.000）
ALT（U/L）	65.350	0.827 （0.700,0.954）	1.000（1.000,1.000）	0.710（0.550,0.870）	0.438（0.194,0.681）	1.000（1.000,1.000）
HA（mg/L）	331.905	0.825 （0.650,1.000）	0.714（0.380,1.000）	0.839（0.709,0.968）	0.500（0.190,0.810）	0.929（0.833,1.000）
LN（ng/L）	182.012	0.876 （0.763,0.988）	0.857（0.598,1.000）	0.871（0.753,0.989）	0.600（0.296,0.904）	0.964（0.896,1.000）

CI：置信区间

图5 使用Spearman相关分析分析大鼠肝脏镉水平与肝脏胆汁酸（GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA）之间的相关性（n = 38）。肝脏镉水平与肝脏胆汁酸（GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA）呈正相关（P < 0.01）。每个部分的颜色与相关系数成正比（绿色，负相关；红色，正相关）。行、列：镉、胆汁酸。

③ 血清胆汁酸检测是镉致肝损伤简便、可行、适宜的检测方法。

胆汁酸分布广泛，主要存在于肝脏、血清、盲肠内容物和粪便，当某些外在因素介入干扰胆汁酸的平衡时，整个肝肠循环过程中的胆汁酸谱都会发生变化。本研究通过对血清、盲肠内容物和粪便胆汁酸进行检测，发现血清TBAs、G-CBAs随镉暴露剂量的增加而增加，再分析其中显著增加的胆汁酸GCA、GCDCA、G/TUDCA、G/TDCA、G/TLCA也与AST、ALT、CHE、HA、LN、PcⅢ呈正相关，与TC呈负相关（图6、表3）。由此可见，血清胆汁酸中的单个胆汁酸的浓度和整个胆汁酸谱的变化都与肝脏胆汁酸相同。因此血清胆汁酸能很好的反映肝脏中胆汁酸的变化，又因为肝脏胆汁酸的检测是有创且不方便的，检测血清成为一个很好的选择。

图6 镉暴露处理后大鼠血清、盲肠内容物和粪便中胆汁酸组成的变化。不同组别中血清 T-CBA、G-CBAs 和 UCBAs 的（A）比例和（B）浓度以及（C）TBA 的浓度。（D）不同组别盲肠内容物中 T-CBAs、G-CBAs和 UCBAs 的比例和（E）浓度以及（F）TBA 的浓度。（G）不同组别粪便中 T-CBAs、G-CBAs 和 UCBAs 的比例和（H）浓度以及（I）TBA 的浓度。（J）血清单个胆汁酸浓度。中位数和四分位数间距[median（P25-P75）]表示（n=6-8）。与对照组相比， * P < 0.05，** P < 0.01。

表3 血清胆汁酸和肝功能、肝脂肪变性和肝纤维化指标的相关性分析

胆汁酸	AST	ALT	CHE	TC	HA	LN	PCIII
UDCA	0.554**	0.683**	0.306**	–0.197	0.435**	0.389*	0.227
LCA	0.420**	0.568**	0.475**	–0.215	0.653**	0.481**	0.413**
GCA	0.656**	0.670**	0.510**	–0.443**	0.581**	0.520**	0.197
GCDCA	0.763**	0.783**	0.502**	–0.416**	0.643**	0.563**	0.244
GUDCA	0.740**	0.707**	0.493**	–0.533**	0.716**	0.648**	0.449**
GDCA	0.681**	0.724**	0.493**	–0.488**	0.757**	0.601**	0.381*
GLCA	0.476**	0.618**	0.494**	–0.263	0.646**	0.547**	0.336*
TUDCA	0.464**	0.467**	0.392*	–0.377*	0.496**	0.306	0.174
TDCA	0.420**	0.360*	0.413**	–0.445**	0.454**	0.289	0.122
TLCA	0.477**	0.445**	0.306	–0.272	0.590**	0.502**	0.119

r: Spearman相关性分析

与对照组相比，*表示P<0.05, **表示P<0.01。

④ 人类血清GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA 可用于诊断镉致肝损伤以及反映人体的血镉水平

基于胆汁酸代谢在大鼠中的重要作用，迫切需要在人群中对其进行验证以便更好地应用于临床。为了排除其他可能导致肝损伤的因素，本研究在纳入人群时已经排除了患有自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、药物性肝损伤等肝脏疾病的人群。除此之外，还增加了二元logistic回归分析来调整人类队列中的一些参数（年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、饮茶、饮食结构、血镉（blood Cd, BCd）），发现只有BCd是与肝损伤相关的独立因素（表4、5）。由此可见，在本研究的人群队列当中，镉是引起肝损伤的唯一因素，避免了其他因素影响引起的误差。

表4 受试者基本信息（n = 403）

	对照地区（n = 135）	Cd暴露地区（n = 268）	p
性别			0.220
男	43（0.32）	102（0.38）
女	92（0.68）	166（0.62）
年龄（岁）	57.53±6.79	58.52±7.20	0.186
身高（cm）	161.26±7.61	167.25±92.21	0.452
体重（kg）	60.73±9.10	62.21±10.53	0.077
BMI	23.35±3.13	23.83±3.64	0.190
吸烟			0.691
是	47（0.35）	88（0.33）
否	88（0.65）	180（0.67）
饮酒			0.233
是	19（0.14）	27（0.10）
否	116（0.86）	241（0.90）
喝茶			0.011*
是	72（0.53）	107（0.40）
否	63（0.47）	161（0.60）
饮食结构			0.769
正常	107（0.79）	209 （0.78）
重口	28（0.21）	59（0.22）
BCd （μg/L）	0.080（0.080-0.310）	2.465（0.235-5.205）	0.000**

年龄、身高、体重和 BMI 显示为均值±标准差（mean±SD），并使用Students’t test进行比较；BCd显示为中位数和四分位数间距[median（P25-P75）]，并使用 Kruskal-Wallis秩和检验进行比较；卡方检验用于分类数据，显示为频率（率）。与对照组相比，* P < 0.05，** P < 0.01。

表5 二元logistic回归分析人群肝损伤的独立危险因素（n = 403）

变量	二元logistic回归分析
变量	OR	95%	P
BCd（μg/L）	1.064	（1.000,1.131）	0.049

调整了年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、饮茶、饮食结构的二元logistic回归分析。

进一步研究表明，GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA 与 BCd 水平和肝功能指标（AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、GGT、CHE）呈显著正相关，表明这四种胆汁酸能够反映BCd水平和人群的肝功能异常（图7A）。对受试者的血清胆汁酸（GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA）进行了ROC分析发现AUC均高于0.65，由于其高敏感性和特异性，可用于反映人群中镉暴露引起的肝损伤（图7B、表6）。除此之外，随着BCd水平的增加，血清胆汁酸（GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA）也随之增加，表明这四个生物参数还可用于反应机体的镉暴露水平（图7C-D）。综上所述，GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA对诊断人体镉致肝损伤及BCd水平具有非常重要的作用。

图7 靶向胆汁酸在人群镉致肝损伤中的验证（n = 403）。（A）使用偏相关分析调整年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、饮茶和饮食结构后的受试者血镉水平、肝功能指标（AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、GGT、CHE）和血清胆汁酸（GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA）之间的相关性。血镉水平、肝功能指标与血清GUDCA、GLCA、TDCA、TLCA呈正相关（P < 0.05或0.01）。每个框的颜色与相关系数成正比（蓝色，负相关；红色，正相关）。行、列：胆汁酸、镉、肝功能指标。（B）403名受试者的ROC曲线评估了 GUDCA、GLCA、TDCA和TLCA诊断肝功能异常的敏感性和特异性。数据以 AUC 表示：GUDCA（AUC = 0.868 [0.821, 0.915]）, GLCA（AUC = 0.776 [0.719, 0.833] ）, TDCA（AUC = 0.826 [0.778, 0.873] ）, TLCA（AUC = 0.731 [0.663, 0.799] ）（P < 0.01）。（C-F）健康对照组和低、中、高镉暴露组受试者血清胆汁酸水平变化的比较分析：（C） GUDCA；（D）GLCA；（E）TDCA；（F）TLCA 。与对照组相比，* P < 0.05，** P < 0.01。

表6 检测人群镉致肝损伤的截断值、AUC、灵敏度、特异性、PPV和NPV (n=403)

	截断值	AUC (95%CI)	灵敏度(95%CI)	特异性(95%CI)	PPV (95% CI)	NPV (95% CI)
GUDCA(ng/mL)	26.417	0.868 (0.821, 0.915)	0.875(0.838,0.911)	0.761(0.674,0.848)	0.925(0.895,0.955)	0.642(0.552,0.732)
GLCA(ng/mL)	111.099	0.776 (0.719, 0.833)	0.788(0.742,0.833)	0.663(0.567,0.760)	0.888(0.850,0.925)	0.480(0.393,0.567)
TDCA(ng/mL)	23.715	0.826 (0.778, 0.873)	0.733(0.684,0.782)	0.750(0.662,0.839)	0.908(0.873,0.944)	0.454(0.375,0.533)
TLCA(ng/mL)	9.191	0.731 (0.663, 0.799)	0.945(0.920,0.971)	0.489(0.387,0.591)	0.862(0.826,0.900)	0.726(0.615,0.837)

研究结论：镉暴露可通过引起肝脏胆汁淤积和有毒胆汁酸的增加，导致大鼠肝损伤。其中，GUDCA、GLCA、TLCA和TDCA有望成为早期检测镉致大鼠肝损伤的潜在生物标志物。在大鼠中，血清胆汁酸检测作为一种简单、可行和适宜的方法用于评估镉致肝损伤也被证明。血清 GUDCA、GLCA、TDCA 和 TLCA 被证实对评估人类镉致肝损伤和镉暴露水平也有价值。这些发现为基于靶向胆汁酸代谢组学筛选和验证镉致肝损伤的生物标志物提供了证据。

（3）镉通过改变肝脏代谢途径中DNA甲基化状态而引起肝病

镉是一种普遍存在于环境中的重金属，可通过职业性吸入、饮食摄入、吸烟、环境皮肤接触等途径进入血液。由于其半衰期长，排泄率低，可在肝、肾、生殖系统等各器官长期积累，对人体健康造成各种不良影响。越来越多的证据表明，镉可以通过影响DNA甲基化状态来影响肝脏疾病的进程。作为一种致癌物，研究人员还发现了DNA甲基化在镉诱导肝癌中的作用，如载脂蛋白E和caspase-8的高甲基化。重金属镉污染与肝脏疾病的发生越来越受到研究者的关注。我们利用全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)检测DNA甲基化，研究镉暴露与肝脏损伤之间的关系。

表1 不同序列环境下甲基化C位点的比例
表1 不同序列环境下甲基化C位点的比例
样本	mC 百分比(%)	mCpG 百分比(%)	mCHG 百分比(%)	mCHH 百分比(%)
C1	3.17%	65.31%	0.10%	0.12%
C2	3.19%	65.34%	0.11%	0.13%
C3	3.23%	65.82%	0.13%	0.15%
L1	3.19%	65.40%	0.11%	0.13%
L2	3.13%	64.41%	0.10%	0.11%
L3	3.24%	66.42%	0.11%	0.13%
H1	3.22%	66.32%	0.11%	0.11%
H2	3.16%	64.95%	0.11%	0.12%
H3	3.12%	64.61%	0.08%	0.09%

本研究的目的是探讨镉暴露对肝脏DNA甲基化谱的可能影响，这与单基因甲基化状态分析不同。将SD大鼠暴露于不同浓度的镉镉（2.5mg/Kg ~ 40mg/Kg）环境中90天。随后，通过全基因组亚硫酸氢盐测序（ WGBS）来确定肝脏CpG的整体甲基化状态。为了识别和表征对照、低剂量和高剂量差异甲基化比较的生物过程，我们使用了GO和KEGG富集分析。IGV基因组浏览器用于鉴别差异甲基化基因。最后，通过定量RT-PCR检测该方法鉴定的基因的转录水平。

研究结果和讨论分析：

镉对大鼠生长状态的影响：每周测量一次体重，绘制生长曲线。可以看出，低剂量镉干预小鼠的体重变化不明显，当剂量超过10mg/kg bw/day时，小鼠的生长受到一定程度的抑制。麻醉后取腹主动脉采血，测定肝功能指标。研究发现，当超过10mg/kg bw/day时，AST和ALT也显著增加。

甲基化位点预测：C位点的甲基化发生在三个序列环境中:CpG、CHG和CHH。不同序列环境（CpG、CHH、CHG）下甲基化C位点的比例见表1。我们重点分析了CpG位点的甲基化差异，因为大鼠肝脏的甲基化主要集中在CpG区域，占所有C位点甲基化的65%。

识别差异甲基化区域：我们使用DSS识别分析软件识别差异甲基化区域（DMR）。对照组和low-does组之间有2093 DMR，对照组和高剂量组之间有2449 DMR，低剂量组和高剂量组之间为2368 DMRs。

基因功能区甲基化分布：C位点位于不同的基因组功能区域，如启动子、外显子、内含子、CGI （CpG Island）、CGI shore、repeat等。与对照组相比，5mg/Kg组各功能区DNA甲基化水平无显著差异（图1a），40mg/Kg组启动子和外显子DNA甲基化下降。同时，与低剂量组相比，高剂量组上述两个区域的甲基化水平也呈现下降趋势（图,1b和1c）。启动子区甲基化在基因表达中起着重要作用，Cd可能通过降低启动子区甲基化水平来调控一些关键基因的表达，并可能表现出剂量效应关系。与启动子甲基化相比，外显子甲基化更直接地反映基因表达。

图1 CG位点甲基化。横坐标代表不同的基因组元素，纵坐标代表甲基化水平，不同颜色代表组。

DMR相关基因KEGG富集分析：KEGG富集分析显示，低剂量组与对照组相比存在差异富集通路：“代谢通路”、“催产素信号通路”和“贴壁连接”。“钙通道信号”也密切相关，排在第四（图2a）。高剂量组与对照组相比，“代谢途径”、“癌症途径”和“醛固酮短而分泌”排名前三位。高剂量组与低剂量组的信号通路差异为“Rap1信号通路”、“轴突引导”和“代谢通路”（图2c）。众所周知，DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关，在差异富集的通路中可以很好地体现出来。“癌症途径”都位于显著位置。与此同时，MAPK、PI3K-Akt、cAMP信号等一些经典类型的通路也反映在差异通路中（图2）。

图2 KEGG富集分析结果的散点图。

差异甲基化基因验证：启动子区DNA甲基化对基因表达有直接影响。在我们的测序数据中，我们发现了一个我们感兴趣的基因，F2rl3，它在高剂量镉暴露组中降低了20%的甲基化水，所以我们使用IGV基因浏览器进行编辑操作并显示（图3）。研究指出，吸烟者中F2rl3的甲基化水平显著降低。进而引发代谢疾病，如肥胖和动脉粥样硬化。结合我们的研究结果，可能与吸入含镉烟雾有关。同时，我们将设计进一步的实验来验证这一假设的科学性。

图3 差异甲基化基因 F2rl3 的 IGV 浏览器可视化。

本项目建立不同浓度慢性镉干预大鼠模型，利用WGBS检测肝脏组织全基因组甲基化水平。结果表明，DNA甲基化程度与镉浓度呈正相关，且在启动子区存在较多的差异甲基化位点。GO和KEGG分析表明，无论干预浓度如何，与环境刺激相关的分子均显著富集，差异主要表现在细胞通讯和细胞迁移方面。高剂量镉干预后，F2rl3基因表现出明显的低甲基化。同时，有研究指出吸烟人群F2rl3的去甲基化状态与心血管和代谢性疾病密切相关。这为镉的流行病学研究提供了新的思路。然而，尽管使用了随机抽样技术，我们的测序结果仍然是基于相对较小的样本容量，这可能不能提供足够的信息来支持我们的假设。需要进一步的大规模研究来确定区域甲基化F2rl3在镉诊断中的准确性。

（4）转录组学揭示肝脏镉暴露后脂质代谢紊乱和肝脂肪变性倾向

镉是生物体生长发育的非必需元素。环境中的镉进入机体后，经过积累和扩散会对组织造成损害，导致机体中毒和细胞毒性。由于其毒性和致癌性，世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）将镉列为第一类环境致癌物，联合国环境规划署（UNEP）认为镉是12种具有全球意义的有害物质中的第一位。流行病学研究表明，环境镉暴露与高脂血症、肥胖、动脉粥样硬化[等脂代谢疾病的发生密切相关。非酒精性脂肪肝病是指以肝细胞内脂肪过度沉积为特征，与胰岛素抵抗和遗传易感性相关的获得性代谢应激性肝损伤的临床病理综合征。研究指出，镉暴露还可引起血脂水平变化和肝脏脂代谢异常。在中年人群中，非酒精性脂肪肝病与Cd暴露之间的联系已得到证实。但其具体机制尚步明确，需要进一步研究。

研究方法如下：

构建镉染毒动物和细胞模型：16只雄性Sprague Dawley大鼠（4周龄，体重120-150g），随机分为2组（n = 8/组）。正常对照组每日灌胃生理盐水；镉干预组每日灌胃5mg/kg氯化镉。连续12周，每周6天，镉染毒结束后麻醉处死大鼠。大鼠正常肝细胞株BRL3A，使用10% FBS+1%双抗的 DMEM 培养基进行培养，并在在培养基中加入CdcCl2，使其终浓度分别为0，0.5uM，2uM和5uM，持续培养12周。

转录组测序和数据分析：提取肝脏组织RNA，检测RNA的纯度和浓度，后进行转录组测序，使用DESeq2 R包对两组进行差异表达分析，采用clusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用Cytoscape绘制蛋白蛋白相互作用网络，并分析它们的枢纽因子。

组织病理学和荧光实时定量PCR验证：将切除的组织保存在10%的甲醛中，包埋，脱蜡后切片用苏木精-伊红染色进行组织学评价肝脏损伤程度，通过qRT-PCR验证代谢通路中的关键差异表达基因的表达情况。

研究结果和讨论分析：

动物模型评估：通过3份实验组和3份对照组ICP-MS检测，6份样品血清中Cd水平分别为1.375 lg/L、0.625 lg/L、0.425 lg/L，3.525 lg/L、7.5 lg/L、6.375 lg/L，与对照组相比，处理组Cd含量显著增加。肝功能结果显示，Cd干预后丙氨酸转氨酶（ALT）水平显著升高，其他差异不明显。

差异基因筛选：每个基因的表达量估计为FPKM，基因表达定义为FPKM大于0.1，测序样本中共检测到18 617个基因。对照组和Cd干预组共273个差异基因，其中Cd干预组146个基因表达上调，127个基因表达下调（（log2FCj>0, padj<0.05）。

差异基因GO富集分析：从富集分析的结果中，选择30个最重要的项目来绘制一个直方图来显示（图1（a））。其中，在生物过程分类下共标注了70个簇，最显著的3个项目依次为固醇生物合成过程、类固醇代谢过程和仲醇生物合成过程。有向无环图（DAG）是另一种用于差异基因氧化石墨烯富集分析的图形显示方法。从图中可以看出，富集范围向下集中到:甾醇生物合成过程、仲醇生物合成过程、单羧酸代谢过程（图3（b））。图3（c）和图3（d）为高表达差异基因和低表达差异基因的GO富集结果。高表达基因与上述结果相似，地面表达主要富集在氨基酸分解代谢和内质网应激反应中。

图1 差异表达基因的GO富集分析。 (a, c, d) 富集分析的直方图。 (b) 有向无环图。

差异基因KEGG分析：KEGG富集分析显示，存在差异富集通路23条。前三名分别是化学致癌、类固醇激素生物合成和视黄醇代谢。在前10条代谢途径中，有6条与脂质代谢有关:类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、类固醇生物合成、亚油酸代谢、脂肪酸降解、花生四烯酸代谢。

图2 差异表达基因 (DEG) 的 KEGG 分析。差异富集程度从左到右递减。

蛋白蛋白互相作用：基于交互式基因数据库搜索工具STRING，构建了一个PPI网络来描述蛋白质之间的复杂关系。如图3（a）所示，两个群体中由差异基因编码的蛋白呈现出复杂的相互作用网络。Cyp1a1（细胞色素P450家族成员）和Cyp2b1位于PPI网络的中心节点。图3（a）中也出现了胰岛素抵抗和NAFLD。为了进一步了解Cyp1a1和Cyp2b1的局部功能，我们重点研究了其周围环境（图3（b,c））。这两种基因的亲缘关系非常密切，而且有很多基因将它们连接在一起，比如Fdft1、Gstp1、Nrfi3。它们在类固醇激素的生物合成、视黄醇代谢和化学致癌作用中发挥重要作用。

图3 分析差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。正方形代表KEGG term，圆圈代表基因，五角星代表转录因子。 (a) 整体网络图。 (b) Cyp1a1 网络。 (c) Cyp2b1 网络。

组织病理：亚慢性镉暴露后，肝脏组织病理发生了一些变化。对照组肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，汇管区结构正常（图4（a c））。5.0 mg/kg Cd干预组炎症细胞浸润，偶尔肝细胞呈点状坏死（图4（d,e））。

图4 大鼠肝组织病理HE染色。从左至右依次为肝小叶结构（×100）、中央静脉区（×400）和歧管区（×400）。 (→) 炎症细胞浸润。

体外实验功能差异基因PCR验证：从大鼠细胞中提取RNA，通过qRT-PCR验证单变量Cd干预后实验结果的一致性。从功能和代谢途径两方面论证了镉暴露对肝脏损伤的作用机制。Mts相关基因Mt1和Mt2a的表达与Cd呈剂量依赖关系。内质网应激和肝脏解毒的关键基因ATF4和Gstp1也显示出同样的趋势。PPI网络中心节点的PPI也通过PCR得到验证。同时验证了脂肪酸降解代谢途径中的Adh4、Adh6、Acat2，以及花生四烯酸代谢途径中的Cyp1a1、Cyp2b2、Pla2g2d、Cyp2j4、Cyp2c6v1、Cyp2c22，其表达模式与转录数据一致。

综上所述，本研究从RNAseq中获得的转录本数据具有较高的准确性和可重复性。实验干预后的基因表达模式提示脂质代谢可能参与了Cd毒性的发病机制，这些变化可能发生在肝脏实质性病变发生之前。Cyp1a1和Cya2b1在治疗组中差异表达较高，在cd诱导的NAFLD的发生发展中发挥重要作用。因此，Cyp1a1可能成为Cd暴露后肝脏脂肪变化的早期预警因子。然而，尽管我们使用了随机抽样技术，但我们的测序范围的结果是基于相对较小的样本量，这可能不能提供足够的信息来支持我们的假设。需要进一步的大规模研究来确定Cyp1a1在Cd诊断中的准确性，以及Cyp1a1水平与可用治疗方案之间的关系。

2-2. 查尔酮衍生物，（2E）-1-（2,4,6-三甲氧基苯基）-3-（3-硝基苯基）-2-丙烯-1-酮，通过调节ERK/MAPK通路促进肝癌细胞凋亡

肝细胞癌（HCC）是2020年全球第三大癌症死亡原因，由于多靶点的联合机制尚不清楚，高复发率和耐药性是HCC相关死亡的主要原因，因此，全面抑制多个分子靶点的新策略备受期待，小分子多靶点抑制剂仍在向前发展并具有吸引力。天然化合物具有多样的化学结构，是抗癌药物的一个组成部分，大约 47%的抗癌药物来自天然产物。查尔酮及其衍生物对癌细胞具有广泛的抗增殖活性，这可能为靶向肿瘤治疗带来光明。然而，查尔酮及其衍生物作为影响抗癌表型的多靶点抑制剂的作用尚未完全阐明。查尔酮衍生物，（2E）-1-（2,4,6-三甲氧基苯基）-3-（3-硝基苯基）-2-丙烯-1-酮（TMONC），其靶向抗肿瘤机制尚未被揭示。基于TMONC的抗增殖和促凋亡活性，我们全面揭示了其调节恶性表型的作用，以及其作为肝癌细胞多靶点抑制剂的可能机制。

首先，通过克隆形成实验、划痕及Transwell实验发现TMONC抑制肝癌细胞的增殖和迁移，流式实验表明TMONC促进肝癌细胞凋亡和细胞周期阻滞。然后，我们通过western blot实验验证了TMONC影响了线粒体途径相关蛋白的变化（caspase-3、cleaved caspase-3、PARP-1、cleaved PARP-1、BAX、Bcl-2、STAT3），并且增加了DNA的损伤（p-γ-H2AX上调）。接着，用TMONC处理的肝癌细胞做RNA-seq测序发现ERK/MAPK信号通路富集明显，western blot实验进一步验证了该通路相关分子下调。最后，反向对接分析发现，ERK1和PARP-1是TMONC的显著靶向分子。总之，我们的数据证明TMONC是一种多靶点抗癌化合物，通过抑制ERK/MAPK通路，激活肝癌细胞凋亡，为肝癌的治疗提供了一种潜在的治疗策略。

图1 TMONC诱导Huh7和Hep3B细胞凋亡。

图2 与TMONC结合紧密的前四个靶点的结合位姿和相互作用模式。

查尔酮化合物因其生物和药理活性而引起了广泛关注。之前合成的查尔酮衍生物TMONC，被证明在Hela细胞中具有较强的细胞毒性和促凋亡活性。在本研究中，我们探讨了TMONC在抑制肿瘤进展方面的特点。从结果中我们发现TMONC可以促进肝癌细胞的凋亡、周期阻滞和DNA损伤。内在和外在凋亡途径中的分子可以互相影响，并最终聚集在caspase-3的激活上。而caspase-3的激活可导致DNA修复酶PARP-1的断裂，并被切割成两个89和24 kDa的催化亚单位，前者进入细胞质，后者保留在细胞核中与DNA结合，抑制PARP-1的活性，这不仅消除了PARP-1对DNA的修复功能，还维持了ATP水平，从而有利于细胞凋亡的发生。我们的研究结果发现TMONC上调了caspase-3、cleaved caspase-3和cleaved PARP-1的表达，下调了PARP-1的表达。DNA损伤和缺氧等刺激诱导p53依赖的凋亡途径，该途径激活促凋亡因子（如Bax），同时抑制抗凋亡因子（如Bcl-2）。我们的结果显示，在用TMONC治疗的HCC细胞中，Bcl-2/Bax的比率也随着Bax的上调和Bcl-2的下调而改变。据报道，下调的STAT3可抑制抗凋亡信号（Bcl-xL、Mcl-1），并激活线粒体凋亡相关信号（Bax、Bak、胞浆细胞色素c和裂解的PARP-1）。在我们的研究中也发现TMONC降低了肝癌细胞中STAT3及p-STAT3的表达。另外，细胞周期异常是细胞凋亡的有效触发因素。抗癌药物可以将细胞周期阻滞在G2/M期，阻止细胞通过p53依赖或p53非依赖途径进入有丝分裂，从而导致DNA损伤。TMONC引起G2/M期阻滞，增加了γ-H2AX和p-γ-H2AX的表达。这种永久性的DNA损伤可能是由于活化的caspase-3引起的，它会降解DNA修复酶和肌动蛋白。我们的RNA-seq测序结果表明TMONC影响ERK/MAPK信号通路最明显。丝氨酸-苏氨酸激酶家族的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）调节多种癌细胞机制，如凋亡、药物敏感性和耐药性等。ERK/MAPK通路是MAPK家族的一条重要通路，关键分子有RAS/RAF/MEK/ERK，大多数在40%以上的人类癌症中发生改变。RAS是一种小GTP结合蛋白，是信号转导途径的上游组分。RAF是RAS的第一个哺乳动物效应器，通过与GTP结合被激活，可以磷酸化并激活下游MEK1。MEK是一种双特异性激酶，也磷酸化并激活下游ERK。ERK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被激活后进入细胞核并通过磷酸化激活转录因子。并且ERK可以诱导MAPK信号持续时间的分子传感器c-FOS，通过磷酸化与血清反应因子整合。据报道，ERK信号的激活通过调节细胞生长和分化广泛与抗凋亡作用有关。磷酸化ERK（p-ERK）已被证明与下游效应器相互作用，如Bcl-2家族和caspase信号通路，并调节细胞增殖和凋亡。蛋白c-Myc作为一种核磷蛋白，调节细胞周期进程、凋亡和细胞转化，也是MAPK信号通路诱导的细胞增殖的下游效应器。RNA-seq数据显示，TMONC显著改变RAS、ERK、c-Myc和c-FOS的分子表达。我们的验证结果表明，TMONC处理的肝癌细胞中RAS、ERK、p-ERK、c-FOS和c-Myc的表达均下调。采用反向对接策略寻找关键靶点，发现TMONC与ERK1、PARP-1结合作用最强。

以上结果提示TMONC可能是一种多靶点化合物，通过抑制肝癌细胞中ERK/MAPK信号通路和PARP-1信号，促进线粒体相关的凋亡。本研究为肝癌治疗中促凋亡多靶点抑制剂的开发提供了一种新的先导化合物。

2-3. （2E）-1-（2,4,6-三甲氧基苯基）-3-（3-氯苯基）-2-丙烯-1-酮作为一种多靶点查尔酮衍生物，通过抑制RAS-ERK和AKT/FOXO3a通路促进肝细胞癌细胞凋亡

在全球范围内，肝癌是第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大主要原因。天然产物衍生化合物能够在癌症中比在正常细胞中更常见地诱导凋亡，可能是一种很有前途的治疗方法。因此，迫切需要开发具有高效抗癌活性和较少不良反应的新型有效药物。查尔酮（1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮）是一种天然化合物，具有抗癌等多种生物活性。我们之前合成了一种新的查尔酮类似物，（2E）-1-（2,4,6-三甲氧基苯基）-3-（3-氯苯基）-2-丙烯-1-酮（TMOCC），对多种肿瘤显示出细胞毒性，但TMOCC诱导细胞毒性的机制尚未在HCC细胞中阐明。本研究首次探讨了TMOCC是否参与了肝癌细胞系中凋亡诱导的抗癌反应及其相关信号通路。

细胞计数试剂盒-8和集落形成试验用于评估TMOCC对HuH7和HepG2细胞活力和增殖的影响。流式细胞术检测细胞凋亡。使用western blot评估与DNA修复、凋亡相关因子以及与RAS-ERK和AKT/FOXO3a信号通路相关的蛋白质的表达水平。利用分子对接分析检测TMOCC的潜在靶点。

TMOCC显著抑制HuH7和HepG2细胞的活力和增殖。TMOCC还能促进两种肝癌细胞系的凋亡并诱导DNA双链断裂。TMOCC抑制RAS-ERK和AKT/FOXO3a信号通路，表明关键因子，如RAS、ERK、p-ERK、p-AKT和p-FOXO3a在HuH7和HepG2细胞中均下调。最后，ERK1、PARP-1和BAX被确定为TMOCC的潜在靶点。

图1 TMOCC诱导HuH7和HepG2细胞凋亡和DNA损伤。

图2 凋亡相关因子在HuH7和HepG2细胞系中的表达。

本研究的目的是阐明TMOCC凋亡效应的分子机制，并探索HuH7和HepG2细胞中的特定细胞靶点和信号通路。本研究中，TMOCC抑制了HuH7和HepG2细胞的活力和增殖，促进肝癌细胞的凋亡。我们进一步评估了TMOCC在肝癌中的凋亡效应的调节机制。内源性凋亡通路由BCL-2家族蛋白调节，如抗凋亡因子（如BCL-2）和促凋亡因子（如BAX），并通过外膜上的MPT孔将促凋亡因子引入胞浆以激活caspase-3，后者导致PARP-1的断裂，PARP-1是一种启动DNA修复的多功能蛋白质，并在凋亡过程中破坏DNA。 Cleaved PARP-1与DNA的结合抑制了PARP-1的活性，这不仅消除了DNA修复，还维持了ATP水平，这有利于细胞凋亡的发展。我们推测，由于TMOCC的刺激，ΔψM的减少导致MPT孔的大小增大，从而将促凋亡因子释放到细胞质中，并刺激caspase级联凋亡。我们的结果显示，TMOCC治疗组BAX、cleaved caspase-3和cleaved PARP-1上调，BCL-2和PARP-1下调。此外，BCL-2受上游转录因子STAT3调节，后者介导从细胞表面受体到细胞核的信号转导。另外，STAT3的下调抑制抗凋亡信号（如BCL-XL或Mcl-1），并激活线粒体凋亡相关信号（BAX、BAK、胞浆细胞色素c和切割的PARP-1）以促进凋亡。我们观察到，对p-STAT3的抑制刺激了线粒体依赖性凋亡，这表明TMOCC可能通过调节凋亡相关因子的表达和STAT3的磷酸化来促进凋亡。考虑到细胞凋亡过程可能伴随着DNA的损伤，我们通过western blot验证了DNA损伤标志物H2AX和p-H2AX的上调。接下来，我们确定了TMOCC与致癌信号通路之间的关联。经典的PI3K-AKT和MAPK通路被证明是HCC中的重要信号通路。在我们的研究中，RAS、p-ERK、p-AKT及p-FOXO3a在TMOCC处理后表达下调，表明TMOCC影响了这两条通路。将以上通路中的分子与TMOCC做反向分子对接，结果表明，TMOCC与ERK1、PARP-1和BAX结合较紧密，暗示这三个分子是TMOCC的靶分子。

作为查尔酮衍生物，TMOCC通过抑制RAS-ERK和AKT/FOXO3a信号通路抑制肝癌细胞的存活和增殖并诱导凋亡。TMOCC有望成为靶向ERK1、PARP-1和BAX的潜在抗癌剂，从而为肝癌的治疗提供新的策略。

2-4. N-trans-Feruloyloctopamine Wakes Up BBC3, DDIT3, CDKN1A, and NOXA Signals to Accelerate HCC Cell Apoptosis

肝细胞癌是世界上最主要的恶性肿瘤，在肿瘤相关死亡中居第四位。长期以来，天然产物因其好的疗效和低毒性而在癌症治疗中受到关注，对各种疾病表现出广泛的生物活性，如传染病和癌症。N-反式阿魏酸胺（FO）是大蒜皮提取物，具有较高的抗氧化活性，被认为是一种很有前途的抗癌药物。我们前期研究表明，FO通过AKT、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和EMT相关信号抑制肝癌细胞的侵袭。然而，FO药物的靶点和详细机制尚未阐明。本研究采用全基因组转录组谱分析（RNA-Seq）技术，筛选经FO处理的Huh7细胞差异表达基因（DEG），以期揭示其调节特征。

细胞增殖的实时分析：使用xCELigence RTCA DP仪器进行实时细胞分析实验。将5×103细胞接种于16孔板中进行细胞增殖实验，孵育15min后检测基线。细胞孵育10h后，分别向Huh7和Hep3B细胞中加入2.0 mM的FO和DMSO，连续测量每孔的电阻抗近90h。斜率表示每单位时间单元阻抗的增加（斜率=阻抗/时间）。平均±标准差由三个独立重复井计算。

图1 FO抑制Huh7和Hep3B细胞增殖。培养90 h的Huh7和Hep3B细胞的细胞指数值。在整个培养期间以15分钟的频率测量电阻抗。绿色和蓝色曲线分别代表用DMSO和FO处理的Huh7和Hep3B细胞的增殖。

流式细胞仪检测：当细胞融合率达到60%时，分别用FO和DMSO处理Huh7和Hep3B细胞，24小时后用不含EDTA的胰酶消化。收集细胞后，用冷PBS洗涤2次，再以1×106细胞/毫升的1X结合缓冲液悬浮。然后，加入5μL的FITC Annexin V和5μL的PI，轻轻旋转细胞，在25°C的RT下黑暗中孵育15分钟。最后加入400μL/1×buffer，1h内进行流式细胞仪分析。用BD LSR II研究细胞凋亡。使用FlowJo软件分析数据。

实时定量聚合酶链式反应分析：采用PCR验证FO处理的HuH7中参与“PI3K-AKT”和“凋亡”信号通路的4个代表基因。用TRIzol提取总RNA。根据制造商的说明，使用PrimeScrip RT试剂盒合成双链cDNA。随后，使用SYBR PreMix Ex Taq™II进行Q-PCR.。用2−ΔΔCT法定量各基因的相对表达，以GAPDH为内对照。所有的实验进行三次重复。

图2 FO促进Huh7和Hep3B细胞凋亡。分别用DMSO、FO处理Hep3B和Huh7细胞24小时和48小时，Annexin V和PI染色。

图3 RNA-Seq数据的实时RT-PCR验证。BBC3、DDIT3、CDKN1A和NOXA。经t检验统计比较：∗P<0：05；∗∗P<0：02；∗∗∗P<0：01。

临床上，无节制的增殖是肿瘤细胞的主要模式，因此，诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的主要策略。Puma（BBC3）和NOXA（PMAIP1）是bc1-2家族的成员，它们都对各种细胞内应激信号做出反应，如缺氧、生长因子或细胞因子的丢失、DNA损伤和抗癌药物，调节细胞死亡。BBC3和NOXA是唯一的BH3蛋白，具有促凋亡活性，可以结合抗凋亡蛋白并抑制其活性。此外，它们还可以直接或间接影响BAK和BAX。

CDKN1A（P21）是一种细胞周期依赖的激酶抑制因子，已被确定为P53下游的靶基因，可通过激活肿瘤坏死因子受体或诱导促凋亡蛋白Bax促进许多肿瘤类型的细胞凋亡。与PUMA和NOXA类似，p21也可以通过调节线粒体膜通透性的变化来调节细胞的凋亡。

FO可能是一种促进肿瘤细胞凋亡的多靶点药物。FO可诱导ROS的产生，激活P53，进而上调CDKN1a的水平。CDKN1A的表达上调往往伴随着PUMA和NOXA的激活。同时，上调的CHOP可能激活内质网应激。同样，CHOP的升高也介导了PUMA和NOXA的表达。因此，我们推测PUMA和NOXA可能是该信号通路下游的关键靶点，并且都受CDKN1A和CHOP的调控。

本研究一方面证实了FO抑制Huh7和Hep3B细胞增殖和促进细胞凋亡，另一方面，筛选到受FO调控的关键途径和潜在的靶基因。但FO通过调节候选基因的表达来介导信号转导的具体机制仍不清楚。我们还需要在随后的分子生物学和组织病理学实验中揭示这一假说。总之，本研究表明重组的FO通过对关键信号基因的作用而抑制肿瘤，有望成为一种很有前途的抗肿瘤药物。

2-5. 葡萄糖调节蛋白78对肝癌预后及肿瘤细胞增殖的影响

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤，其中肝细胞癌（简称肝癌）发病率在全世界恶性肿瘤中排名第6，病死率排名第4。肝癌病人术后5年总体生存率<40.0%，复发率为40.0%~70.0%，即使复发后再次切除或行肝移植，病人3年总体生存率仅为52.6%。化疗、靶向治疗等辅助治疗仍无法满足临床需求，因此，寻找更有效的肝癌预后生物分子和治疗靶点具有重要临床意义。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）是热休克蛋白70家族重要成员，发挥维持细胞稳态作用。GRP78在促进肿瘤生长、迁移和耐药过程中发挥重要作用，但具体分子机制尚未阐明。本研究采用肝癌组织芯片及体外培养肝癌细胞和正常肝细胞实验，分析GRP78对肝癌预后及肿瘤细胞增殖的影响。

采用实验研究方法和回顾性队列研究方法。采用肝癌组织芯片，体外培养Huh7、Hep3B肝癌细胞和 LO2正常肝细胞，结合免疫组织化学染色、细胞转染、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT‑PCR）、Western blot检测、细胞增殖实验、细胞克隆形成实验及高通量转录组学检测分析肝癌细胞 GRP78表达情况。Hep3B、Huh7细胞转染 GRP78基因特异性 shRNA 慢病毒设为 GRP78shRNA 组，转染阴性对照 shRNA 慢病毒设为对照‑shRNA 组。观察指标：（1）肝癌组织和癌旁组织GRP78表达及其与临床病理特征的关系。（2）肝癌病人预后及影响因素分析。（3）抑制 GRP78表达对肝癌细胞增殖的影响。（4）抑制GRP78表达对肝癌细胞p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达的影响。（5）HA15 对肝癌细胞增殖和 p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 基因和蛋白表达的影响。正态分布的计量资料以 x±s表示，组间比较采用 t检验或方差分析。重复测量数据采用重复测量方差分析。计数资料以绝对数表示，组间比较采用 χ²检验。单因素和多因素分析采用 COX 比例风险回归模型。采用Kaplan‑Meier法计算生存时间并绘制生存曲线，采用Log‑rank检验进行生存分析。

研究结果和讨论分析：

（1）肝癌组织和癌旁组织GRP78表达及其与临床病理特征的关系：肝癌组织芯片免疫组织化学染色结果显示，GRP78在 90例肝癌组织中低表达 53例，高表达 37例，GRP78在 90例癌旁组织中低表达 84例，高表达6例，肝癌组织与癌旁组织比较，差异有统计学意义（χ²=21.291，P<0.05）。

（2）肝癌病人预后及影响因素分析：90 例病人均获得随访，随访时间为 5～56 个月，中位随访时间为 49 个月。53 例 GRP78 低表达肝癌病人中位总体生存时间和中位疾病无进展生存时间分别为 56 个月和 53 个月，37例 GRP78 高表达肝癌病人上述指标分别为 32 个月和 19 个月，两者比较，差异均有统计学意义（χ²= 17.482，12.097，P<0.05）。单因素分析结果显示：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肿瘤病理学分级、GRP78 表达是影响肝癌病人3年总体生存率和疾病无进展生存率的相关因素（风险比=2.168，2.161，3.784和 2.254，0.893，3.493，95% 可信区间为 1.061~4.432，1.069~4.368，1.793~7.989 和 1.096~4.636，0.438~ 1.818，1.631~7.252，P<0.05）。多因素分析结果显示：ALT>40 U/L、肿瘤病理学分级为Ⅲ~Ⅳ级、GRP78 高表达是影响肝癌病人 3年总体生存率和疾病无进展生存率的独立危险因素（风险比=2.317，2.039， 3.740 和 2.194，2.177，2.927，95% 可信区间为 1.150~4.671，1.201~3.462，2.116~6.612 和 1.408~4.593， 1.093~4.336，1.492~5.742，P<0.05）。

（3）抑制 GRP78 表达对肝癌细胞增殖的影响：①qRTPCR 检测结果显示，GRP78 mRNA 在 Huh7、Hep3B、LO2 细胞中的相对表达量分别为 3.06±0.33、4.42±0.60、1.00± 0.02，Huh7、Hep3B 细胞分别与 LO2 细胞比较，差异均有统计学意义（F=34.065，97.362，P<0.05）。② Western blot 检测结果显示：GRP78蛋白在 Huh7、Hep3B、LO2细胞中的相对表达量分别为 1.65±0.01、 1.77±0.01、0.99±0.02，Huh7、Hep3B 细胞分别与 LO2 细胞比较，差异均有统计学意义（F=1 391.050， 1 942.270，P<0.05）。③细胞增殖实验检测结果显示：Huh7细胞GRP78shRNA组和对照shRNA组24、 48、72、96 h 细胞增殖率分别为 111.51%±0.35%、144.85%±0.68%、188.71%±3.62%、282.51%±5.25% 和190.08%±0.58%、285.76%±2.69%、459.51%±4.29%、597.88%±12.25%，两组比较，差异有统计学意义（F 组间=1 360.000，F 时间=668.500，F 交互=197.600，P<0.05）。Hep3B细胞GRP78shRNA组和对照shRNA 组上述指标分别为 124.47%±0.25%、153.25%±1.25%、195.45%±3.19%、282.51%±10.76%和179.69%± 0.33%、322.67%±2.46%、486.27%±5.82%、622.35%±12.58%，两组比较，差异有统计学意义（F组间=1 222.000， F 时间=706.200，F 交互=179.600，P<0.05）。④细胞克隆形成实验结果显示：Huh7 细胞 GRP78shRNA 组和对照shRNA 组细胞数分别为（125±3）个和（435±17）个，两组比较，差异有统计学意义（t=17.86，P< 0.05）；Hep3B细胞GRP78shRNA组和对照shRNA组上述指标分别为（138±3）个和（388±7）个，两组比较，差异有统计学意义（t=32.29，P<0.05）。

（4）抑制 GRP78 表达对肝癌细胞 p53、p21、CDK2、CDK4、 CDK6基因和蛋白表达的影响：高通量转录组学检测结果显示，Huh7细胞 GRP78shRNA 组相对于对照shRNA组的p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6表达率分别为19%、334%、398%、41%、49%。①qRTPCR 检测结果显示：Huh7细胞GRP78shRNA组和对照shRNA组中，GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA 的相对表达量分别为 0.17±0.03，4.05±0.71，3.73±0.47，0.49±0.09，0.48±0.06，0.36±0.07 和 1.00± 0.05，1.03±0.17，1.00±0.07，1.01±0.09，1.02±0.14，1.00±0.03，两组比较，差异均有统计学意义（t=14.62， 4.17，5.72，4.26，3.49，8.82，P<0.05）。Hep3B 细胞 GRP78shRNA 组和对照shRNA 组上述指标分别为 0.11±0.01，4.28±0.43，4.19±0.22，0.44±0.01，0.25±0.03，0.68±0.04 和 1.01±0.09，1.02±0.15，1.00±0.06， 1.01±0.09，1.01±0.08，1.15±0.02，两组比较，差异均有统计学意义（t=10.19，7.14，13.79，6.37，9.42，9.61， P<0.05）。②Western Blot 检测结果显示：Huh7 细胞 GRP78shRNA 组和对照shRNA 组中，GRP78、 p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白的相对表达量分别为 0.45±0.01，1.98±0.05，2.31±0.12，0.75±0.03， 0.69±0.04，0.82±0.03 和 1.01±0.05，1.03±0.01，1.00±0.02，1.00±0.01，1.01±0.02，1.00±0.03，两组比较，差异均有统计学意义（t=11.07，14.56，11.30，11.29，10.55，11.37，P<0.05）。Hep3B细胞GRP78shRNA组和对照shRNA 组上述指标分别为 0.61±0.03，1.98±0.16，2.55±0.12，0.85±0.03，0.78±0.01，0.54±0.02 和 1.00±0.03，1.05±0.02，1.05±0.01，1.05±0.02，1.00±0.02，1.00±0.02，两组比较，差异均有统计学意义（t= 10.97，13.40，12.35，11.06，12.45，13.78，P<0.05）。

（5）HA15 对肝癌细胞增殖和 p53、p21、CDK2、CDK4、 CDK6基因和蛋白表达的影响：HA15半抑制浓度（IC50）实验结果显示，Huh7、Hep3B细胞48 h IC50分别为9.98 μmol/L、13.70 μmol/L。①分别以9.98 μmol/L和13.70 μmol/L HA15作用Huh7、Hep3B细胞，细胞增殖实验检测结果显示：HA15Huh7 细胞和正常 Huh7 细胞 24、48、72、96 h 细胞增殖率分别为 112.81%±0.27%、154.71%±1.45%、237.66%±16.77%、294.40%±14.92% 和 133.67%±0.49%、352.93%± 2.31%、557.17%±4.89%、662.60%±13.31%，两者比较，差异有统计学意义（F 组间=766.800，F 时间=518.200， F 交互 =133.300，P<0.05）；HA15 Hep3B 细胞和正常 Hep3B 细胞上述指标分别为 121.27%±2.32%、 203.85%±3.18%、240.80%±3.02%、286.50%±7.10% 和 239.14%±1.02%、362.00%±5.44%、539.37%± 10.80%、694.79%±17.13%，两者比较，差异有统计学意义（F 组间=594.300，F 时间=317.900，F 交互=78.600， P<0.05）。②qRTPCR 检测结果显示：HA15Huh7 细胞和正常 Huh7 细胞中，GRP78、p53、p21、CDK2、 CDK4、CDK6 mRNA 的相对表达量分别为 0.27±0.05，3.64±0.28，4.13±0.41，0.51±0.07，0.39±0.03，0.17± 0.02和1.02±0.14，1.00±0.03，1.00±0.05，1.01±0.08，1.01±0.09，1.03±0.17，两者比较，差异均有统计学意义（t=5.00，9.25，7.63，4.73，6.82，5.01，P<0.05）；HA15Hep3B 细胞和正常 Hep3B 细胞上述指标分别为 0.28±0.03，3.49±0.78，4.31±0.53，0.38±0.05，0.36±0.04，0.24±0.03 和 1.01±0.11，1.03±0.18，1.01±0.08， 1.00±0.06，1.02±0.15，1.00±0.06，两者比较，差异均有统计学意义（t=6.26，3.08，6.21，7.97，4.26，11.08， P<0.05）。③Western blot 检测结果显示：HA15Huh7 细胞和正常 Huh7 细胞中，GRP78、p53、p21、 CDK2、CDK4、CDK6 蛋白的相对表达量分别为 0.52±0.05，1.94±0.08，1.58±0.02，0.89±0.00，0.86±0.02， 0.74±0.01 和 1.02±0.03，1.00±0.03，1.02±0.02，1.04±0.03，1.00±0.01，1.01±0.02，两者比较，差异均有统计学意义（t=11.54，10.28，11.03，12.81，13.67，10.09，P<0.05）。HA15Hep3B细胞和正常Hep3B细胞上述指标分别为 0.57±0.02，1.67±0.04，1.41±0.04，0.82±0.03，0.70±0.02，0.74±0.01 和 1.03±0.01，0.98± 0.03，1.00±0.03，1.03±0.03，1.01±0.01，1.04±0.01，两者比较，差异均有统计学意义（t=10.81，11.54，12.26， 13.62，14.23，10.17，P<0.05）。

图1 葡萄糖调节蛋白（GRP）78在肝癌癌旁组织和癌组织中的表达 1A：GRP78在癌旁组织中表达免疫组织化学染色低倍放大；1B：GRP78在癌旁组织中表达免疫组织化学染色中倍放大；1C：GRP78在癌组织中表达免疫组织化学染色低倍放大；1D：GRP78在癌组织中表达免疫组织化学染色中倍放大。

图2 53例葡萄糖调节蛋白 78 低表达和 37 例葡萄糖调节蛋白78高表达肝癌病人总体生存曲线。

图3 53例葡萄糖调节蛋白78低表达和37例葡萄糖调节蛋白78高表达肝癌病人疾病无进展生存曲线。

本研究结果显示：GRP78表达在肝癌与癌旁组织中比较，差异有统计学意义；GRP78 高表达是影响肝癌病人 3 年总体生存率和疾病无进展生存率的独立危险因素；抑制肝癌细胞GRP78 表达可抑制细胞增殖活性。这提示 GRP78与肝癌进展和预后密切相关。目前关于 GRP78 促进肿瘤增殖的分子机制研究结果显示：PI3K/AKT 通路发挥重要作用。本研究结果显示：抑制肝癌细胞GRP78表达可抑制p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 基因和蛋白表达。已有的研究结果显示：HA15 可通过抑制细胞 ATP 酶活性诱导自噬和凋亡。本研究结果显示：HA15 能够抑制肝癌细胞 GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 基因和蛋白表达及细胞增殖活性。笔者认为：靶向抑制肝癌细胞 GRP78 表达可能通过 p53 及其相关分子 p21、 CDK2、CDK4、CDK6 发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，详细的分子间信号关系尚需进一步分析。综上，GRP78高表达是影响肝癌病人 3年总体生存率和疾病无进展生存率的独立危险因素，抑制 GRP78表达可抑制肝癌细胞增殖活性及影响 p53、 p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达。

2-6. PCGF2与PCGF4在肝癌干细胞中反向调控干性

PCGF4 作为癌症干细胞的标志物。PCGF2属于PCGF4的同源物，但PCGF2对肝癌干细胞的干性维持和耐药性的影响以及这种影响的分子机制未知。

免疫组化结果显示PCGF4和PCGF2的表达在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中呈负相关。PCGF2过表达降低癌干细胞的球形成和自我更新能力，以及肝癌干细胞的表面标记物。有趣的是，敲低PCGF4后与过表达PCGF2得到相似的结果。进一步的实验结果揭示PCGF2和PCGF4反向调节肝癌干细胞干性是由p38 MAPK信号通路驱动。结论：我们的结果表明 PCGF2通过靶向p38 MAPK 信号通路抑制干细胞群，降低原发性肝癌细胞系中球体形成能力，并增加对索拉非尼的敏感性。

研究结果如下：

（1）PCGF4 和 PCGF2 的表达在 HCC 细胞系和 HCC 组织呈负相关

为了确定HCC中的PCGF2和PCGF4表达，我们使用免疫组化检测HCC组织芯片。癌旁组织中PCGF2表达高于癌组织的患者比例为66.26%。PCGF4在癌组织中的表达水平高于癌旁组织（51.76%）（图1A-1B）。正如预期的那样，PCGF4在HCC组织中上调而PCGF2下调。许多癌症中PCGF4的高表达预示着不良预后，Kaplan-Meier生存曲线表明 PCGF4 是总生存期的独立预后指标，但不是累积复发（图1C）。PCGF2 并不是总生存期的独立预后指标（数据未显示）。总之，PCGF4 可能是 HCC预后的独立因素，而不是PCGF2。在细胞系中也发现了相同的结果。我们使用Western Blot检测PCGF4或PCGF2在正常肝细胞系L02和HCC细胞系 Hep3B、Huh7 和 HCCLM3 中的表达。结果显示PCGF4的表达显着高于L02，PCGF2的结果相反（图1D）。

图1 PCGF4 和 PCGF2 的表达在 HCC 细胞系和 HCC 组织呈负相关。

（2）PCGF4 KD减少肝癌干细胞球形成和增殖的能力，PCGF2过表达后球形成能力降低

为了评估PCGF2或PCGF4对细胞增殖的影响，在HCCLM3和Huh7细胞中使用shRNA敲低PCGF4表达（PCGF4 KD），通过western blot证实（图 2A）。由于PCGF2在HCC系中以低水平表达，我们构建了PCGF2过表达（PCGF2 OE）细胞系（图2A-2B）。CCK-8测定用于分析细胞增殖，发现PCGF4 KD后细胞增殖率降低（图2C，2D）。然而，PCGF2 OE并没有显着抑制增殖能力。接下来，我们探讨了PCGF4或PCGF2对球形成的影响，发现PCGF4 KD降低了球的大小和数量（图2E，F）。通过有限稀释法表明，PCGF4 KD或PCGF2 OE细胞中形成球体需要更多数量的细胞（图2G）。

图2 PCGF4 KD减少肝癌干细胞球形成和增殖的能力，PCGF2过表达后球形成能力降低。

（3）PCGF2 和 PCGF4 负向调控肝癌干细胞表面标记物 CD13 和 EpCAM 表达

在HCCLM3和Huh7细胞系中，PCGF4 KD细胞中CD13+/EpCAM+/CD133+细胞的数量显著下调（P<0.01，P<0.01，P<0.001）（图3A-3B）。此外，PCGF2 OE与PCGF4敲低具有相同的效果（图 3A）。总之，这些结果表明 PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 显着降低了 LCSC 表面标志物的表达。

图3 PCGF2 和 PCGF4 负向调控肝癌干细胞表面标记物 CD13 和 EpCAM 表达。

（4）PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 增强细胞对索拉非尼的敏感性

我们比较了索拉非尼对 PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 细胞活力的影响。根据图2A所示的结果，PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 细胞在 24小时内的增殖率与NC细胞的增殖率相同。因此，细胞贴壁后立即加入索拉非尼，24小时内检测细胞活力。PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 细胞在 HCCLM3（P<0.001）和 Huh7（P<0.001）细胞中对 10 μM 浓度的索拉非尼更敏感（图 4A、4B）。总之，这些结果表明 PCGF2 或 PCGF4 反向调节 LCSCs 的干性。

图4 PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 增强细胞对索拉非尼的敏感性。

（5）PCGF2/PCGF4 通过 p38 MAPK 影响 HCC 细胞中的干性

为了阐明PCGF2或PCGF4的下游调控通路，应用公共数据库--人类转录因子靶基因 hTF target和GTRD数据库。受PCGF4调控的靶基因的基因数量（4496，图5A）远大于 PCGF2调控的基因（939，5A），表明 PCGF4 在调节生物事件中的作用比PCGF2更强。PCGF4和PCGF2主要在MAPK信号通路富集（图5A）。MAPK 途径具有三个主要分支途径：ERK、JNK 和 p38 MAPK。其中，JNK 和 p38 具有相似的功能，并且与炎症、细胞凋亡和生长有关，p38 活性在 PCGF4 KD 或 PCGF2 OE 细胞中降低（图 5B）。

图5 PCGF2/PCGF4 通过 p38 MAPK 影响 HCC 细胞中的干性。

2-7. 基质刚度对肝癌细胞干性特征的调控及机制研究

HCC因其耐化疗、耐放疗、易复发等特点，对患者及社会造成很大的负担。肿瘤细胞的微环境又称为肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），其在肿瘤细胞的生长和功能的维持和调节中起到重要作用。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是细胞微环境的重要组成部分。刚度是指ECM在受力时抵抗变形的能力，即引起变形难易程度的表征，是可以反应肝脏硬度的指标。癌症的发生发展是内部的基因异常与外部的因素共同作用所致，基质刚度被认为参与其中。

具有干细胞特性的肝癌细胞（LCSCs）占肝癌细胞的一小部分，与非LCSCs相比，LCSCs具有很强的自我更新和转移潜力。此外，因其对药物和放疗不敏感，在HCC的转移和复发中起关键作用。

研究内容和方法如下：（1）在不同刚度的PA水凝胶上培养肝癌细胞（HCCLM3、Hep3B），检测细胞干性标志物表达水平（荧光定量PCR、流式细胞术、Western blot），（2）机械信号通过哪些信号转导进入细胞，并转换成生化信号调控细胞干性表达（荧光定量PCR）。（3）进一步验证信号通路（Western blot、免疫荧光）。

图1 PA水凝胶刚度越高，肝癌细胞干性相关标志物表达量越高。

图2 Integrin-β1-YAP将细胞外的机械信号转导入细胞内，转换成生物信号，在这个过程中，YAP表达没有发生变化，其下游转录因子表达量升高，说明刚度不是通过调控YAP表达量高低来调节细胞干性表达，而是通过调控YAP功能来调节细胞行为。

图3 进一步查阅文献发现YAP蛋白在细胞内发挥功能是通过核移位、去磷酸化来完成的，细胞免疫荧光结果证实，刚度增加的情况下，细胞内YAP在细胞核聚集。

在HCC中，YAP表达增高与肿瘤细胞分化不良有关，是不良预后的预测因素。更重要的是YAP可以作为介质将细胞外基质的机械信号转化为生物化学信号，从而影响细胞功能。Integrin-β1是细胞膜上感受基质刚度变化并将其转化为生物信号传入细胞内的主要蛋白，可以通过各种信号通路影响肝癌细胞的侵袭、转移及血管形成。YAP及Integrin-β1都是基质刚度调控细胞功能过程中的重要分子，但是这两者之间的联系尚未完全阐明，是否影响肝癌细胞干性表达也未可知。通过实验发现，刚度增高促进肝癌细胞干性标志物的表达，Integrin-β及YAP在这个过程中也发挥了非常重要的调节作用。

2-8. Gly-tRF在肝细胞癌中的表达及功能研究

阐述了Gly-tRF在HCC中发挥促癌作用，探索了Gly-tRF在HCC中发挥功能的潜在机制，并讨论了Gly-tRF可能成为HCC的潜在治疗靶点。发表于Cancer Cell International。

肝癌干细胞（Liver cancer stem cells, LCSCs）的存在和上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）的发生通常被认为是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）迁移和转移的主要原因。越来越多的证据表明，由转运RNA （transfer RNA, tRNA）衍生而来的一类新型调节性RNA分子tRF和tiRNA在多种人类肿瘤中失调并发挥重要作用。然而，它们对肿瘤发生的影响仍处于探索阶段然，它们在肝癌和肝癌干细胞中的作用和机制仍然未知。

采用实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测HCC细胞系和肿瘤组织中甘氨酸tRNA衍生片段（Glycine tRNA-derived fragments, Gly-tRF）的表达。通过inhibitor和mimic 来减弱和增强Gly-tRF的功能。采用Cytation 5™全自动多功能微孔板检测系统来评估Gly-tRF对HCC细胞增殖的影响。通过流式细胞术检测Gly-tRF对HCC细胞凋亡的的影响。采用流式细胞仪和球形成实验检测LCSCs代表性表面标志物（CD133、CD13、EpCAM、CD44）的比例和LCSCs样细胞的球形成能力。进行transwell测定和划痕实验以检测Gly-tRF对HCC细胞迁移的影响，蛋白质免疫印记（Western blot, WB）用于检测EMT核心标志物（N-cadherin, E-cadherin）的丰度。使用在线数据库miRDB预测与Gly-tRF序列互补的下游靶基因，通过qRT-PCR检测候选靶基因mRNA的表达水平，通过生信、免疫组化预测和验证候选靶基因在HCC肿瘤组织中的表达，初步确定NDFIP2为Gly-tRF的下游靶基因。通过双荧光素酶报告系统检测Gly-tRF mimic与NDFIP2 3' UTR共转染后的荧光素酶活性。通过WB和免疫荧光（Immunofluorescence, IF）染色检测Gly-tRF mimic转染后NDFIP2蛋白的表达。接下来，通过球形成实验、transwell和划痕实验进一步研究了NDFIP2的过表达是否能够逆转Gly-tRF对HCC细胞迁移和LCSCs样特性的促进作用。最后，通过Western blot检测了NDFIP2过表达后EMT相关蛋白的丰度。

图1 Gly-tRF促进Huh7细胞中LCSCs样细胞的球形成能力。放大倍数10×10。***P<0.001。

图2 Gly-tRF促进Huh7细胞迁移。（A-B） Gly-tRF inhibitor和Gly-tRF mimic转染的HCCLM3细胞中进行transwell实验以评估Gly-tRF对HCCLM3细胞迁移的影响。放大倍数10×20。*P<0.05。

图3 IF染色检测HCCLM3细胞中E-cadherin的荧光强度。放大倍数10×40。

与L02肝细胞和邻近的正常组织相比，Gly-tRF在HCC细胞系和肿瘤组织中高表达。Gly-tRF mimic可促进HCC细胞迁移，增强LCSCs样细胞亚群的百分比和LCSCs样细胞球体形成能力并抑制HCC细胞凋亡。Gly-tRF inhibitor会抑制HCC细胞迁移并促进HCC细胞凋亡。从机理上讲，NDFIP2是Gly-tRF的直接靶标，Gly-tRF通过与NDFIP2 mRNA 3'UTR结合来抑制NDFIP2的表达。更重要的是，功能回补实验证实NDFIP2的过表达能够逆转Gly-tRF对HCC细胞迁移和LCSCs样特性的促进作用。

在本研究中，发现Gly-tRF在HCC组织和细胞系中表达上调，Gly-tRF引起EMT的表达增加，并获得LCSC样特性。本研究表明Gly-tRF在肝癌中具有促肿瘤作用，这一结果可能为Gly-tRF作为肝癌治疗靶点提供理论依据。然而，临床样本数量少和检测方法的局限性可能会影响Gly-tRF的真实表达。tRF的表达丰度受细胞环境的影响，转录特征也与个体属性有关，tRF参与疾病进展的动态变化有待进一步研究。

图4 Gly-tRF在HCC中发挥促癌作用以及潜在机制。

2-9. 肝癌促癌circRNA的筛选及候选基因hsa_circ_0001387的机制研究

本研究采用Arraystar circRNA microarray测序得到HCC癌组织及癌旁组织差异表达的circRNA,筛选出表达水平存在明显差异的hsa_circ_0001387；（2）验证目的基因在肝癌细胞系（Huh-7、Hep3B、SK-HEP-1、HCCLM3、HepG2）及正常肝脏上皮细胞（L02）中的表达水平差异；（3）临床组织标本验证，在HCC癌组织及癌旁组织中明确目的基因在肝癌组织及癌旁组织中的表达差异；（4）结合临床病理资料，明确目的基因的表达水平与HCC 患者临床病理资料之间的关系；（5）在细胞水平体外探讨hsa_circ_0001387高表达对HCC生物学行为的影响。

研究方法如下：（1）收集4例HCC患者新鲜的肝脏组织标本，采用Arraystar circRNA microarray 测序得到HCC癌组织及癌旁组织差异表达的hsa_circ_0001387，在肝癌细胞系（Huh-7、Hep3B、SK-HEP-1、HCCLM3、HepG2）及正常肝脏上皮细胞（L02）中通过Real-time PCR初步验证Arraystar circRNA microarray 测序的结果；（2）通过Real-time PCR进一步在HCC癌组织及癌旁组织中验证circRNA的表达水平是否存在差异。（3）收集HCC患者的临床病理相关资料，分析circRNA与患者临床病理资料之间是否具备相关性，以及其可能提示的相关临床意义；（4）采用CCK-8，FACS，Transwell等方法探讨hsa_circ_0001387对HCC生物学行为的影响。

图1 hsa_circ_0001387在肝癌组织中的表达水平，在人类HCC组织和邻近正常组织（ANTs）中评估了circRNA表达水平，将37名患者的表达水平标准化为GAPDH水平。结果显示为平均值±标准差。（**P<0.001，two-tailed Student’s t-test）。

图2 hsa_circ_0001387的表的水平与肝癌患者AFP的关系，与AFP相比，circRNA表达水平在HCC组织中具有显着性（**P<0.001，n=37）。将表达水平标准化为GAPDH水平。结果显示为平均值±SD（two-tailed Student’s t-test）。

图3 hsa_circ_0001387敲低对细胞增殖的影响。

图4 hsa_circ_0001387敲低对细胞迁移的影响，Hep3B Transwell。

研究表明：（1）hsa_circ_0001387在肝癌中是上调表达的。（2）hsa_circ_0001387的上调表达与AFP水平密切相关。（3）hsa_circ_0001387敲低以后抑制了HCC细胞的增殖，促进凋亡，抑制转移。

研究结论：（1）hsa_circ_0001387在HCC 肝脏组织中，癌组织的表达水平明显高于癌旁组织，其高表达水平与HCC 患者APF水平密切相关。（2）hsa_circ_0001387敲低以后抑制了HCC细胞的增殖，促进凋亡，抑制转移。

2-10. 全反式维甲酸调节Treg/Th17细胞平衡改善小鼠自身免疫性肝炎的研究

自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）是一种慢性自身免疫性肝病，其发病机制尚未完全阐明，但目前已有的研究表明，免疫调节失衡以及免疫耐受性缺陷是AIH发病的重要因素，其中，抑炎性Treg细胞的免疫调节功能受损以及致病性Th17细胞的分化增加在AIH的发生发展过程中起着核心作用，并且与疾病严重程度和进展密切相关。因此，增加Treg细胞的数量和（或）维持其功能稳定，重塑Treg/Th17细胞平衡，进而诱导和重建自身免疫耐受可能为AIH患者提供一种切实可行的治疗方法。全反式维甲酸（All-trans retinoic acid, atRA）已被证明能够维持Treg细胞的稳定性并促进Treg细胞分化而抑制Th17细胞分化，进而诱导免疫耐受，但其能否通过重塑AIH肝脏免疫微环境中的Treg/Th17细胞平衡改善小鼠AIH 炎性肝损伤尚不明确。

研究内容包括：

1） atRA能够显著改善 AIH小鼠肝功能、减轻其疾病严重程度

观察atRA治疗前后AIH小鼠体重、肝脏生化指标、肝脾指数以及肝组织病理学改变探究atRA对AIH小鼠疾病严重程度的改善作用。

2） atRA通过调控AIH小鼠体内Treg/Th17平衡对AIH起到免疫调节作用

动态监测atRA治疗前后AIH小鼠肝脏和脾脏中Treg、Th17细胞占比及Treg/Th17比值变化；qRT-PCR检测atRA治疗前后AIH小鼠肝组织中Treg转录因子Foxp3、Th17转录因子RORγt的mRNA表达水平及Foxp3/RORγt比值变化，进一步分析以上检测指标变化水平与 atRA治疗前后AIH小鼠肝组织病理学炎症评分的相关性。

3） atRA通过抑制IL-6/STAT3信号转导通路重塑AIH小鼠体内Th17/Treg失衡

动态监测atRA治疗前后AIH小鼠血清IL-6含量，同时检测肝组织中IL-6 及STAT3 的mRNA表达水平；进一步检测肝组织中STAT3总蛋白及磷酸化表达水平，观察atRA 是否通过调控IL-6/STAT3信号通路调节AIH小鼠体内Treg/Th17平衡。

4） atRA可促进Treg细胞的体外诱导分化、抑制Th17细胞的体外诱导分化

免疫磁珠法分选CD4+CD62L+naïve T细胞，并用流式细胞术鉴定所得细胞纯度；将分选所得naïve T细胞加入相应细胞因子进行Treg、Th17细胞的诱导分化，并以atRA干预，观察atRA对Treg、Th17细胞分化的作用。

图1 全反式维甲酸对Treg细胞的免疫调节作用示意图。

图2 小鼠肝脏组织病理学表现：（A）小鼠肝组织切片HE染色。（B）小鼠肝组织病理学HAI评分。**P＜0.05。

图3 小鼠脾脏Th17、Treg细胞比例流式检测结果：（A）小鼠脾脏Th17细胞比例。（B）小鼠脾脏Treg细胞比例。**P＜0.01，***P＜0.001，ns P＞0.05。

图4 atRA调控AIH Treg/Th17细胞平衡模式图。

脏器的组织形态学、脏器重量及脏器系数能够一定程度上反应机体功能状态，尤其是脾脏指数的高低取决于其中淋巴细胞增殖的程度，可粗略估计免疫功能的强弱。本研究中，我们发现模型组的体重下降最为明显，atRA治疗后体重显著增加，模型组肝脾指数显著增大，治疗组显著下降，初步说明atRA治疗AIH有效。ALT、AST或IgG持续升高是肝脏内持续疾病活动的血清生物化学标志物，但血清转氨酶水平并不能精准的反应肝内炎症情况，ALT、AST或IgG浓度均正常的患者在肝活检中仍可能有低级别但实质性的疾病活动状态，其含量升高应始终作为临床诊疗实践中加强治疗的指征之一。肝组织学检查是对AIH炎症活动进行分级和评估纤维化程度的最佳标准，AIH特征性肝组织病理学表现为不同程度的界面性肝炎、门静脉及汇管区的淋巴浆细胞浸润、小叶中央型坏死、肝内Kuffer细胞聚集和肝细胞玫瑰花环样改变等。我们比较了各组小鼠的血清ALT、AST、GLB及肝组织病理学改变。结果表明，与对照组相比，AIH模型组小鼠肝小叶汇管区出现大量炎症细胞浸润，小叶内部分肝细胞呈气球样变性及脂肪变性，部分肝细胞溶解性坏死，排列紊乱，血清ALT、AST及GLB水平升高，但atRA治疗组小鼠血清ALT、AST及GLB水平较模型组明显降低，且肝组织病理损伤较模型组明显改善，说明atRA能够显著改善AIH小鼠肝损伤。

一些研究表明，AIH患者外周血或肝内浸润的Treg细胞数量减少且功能受损，肝脏免疫微环境中Treg/Th17细胞平衡状态的打破是AIH发病机制中的极其关键的因素，并与AIH疾病严重程度及不良预后密切相关。我们的研究结果显示AIH模型组脾脏淋巴细胞总数增多但Treg细胞比例下降，Th17细胞比例上升，Treg/Th17细胞比率减小，atRA治疗组 Treg 细胞比例上升，Th17细胞比例显著下降，Treg/Th17细胞比率增大，因肝组织淋巴细胞数量较少、不易获取，我们采用免疫荧光染色检测了小鼠肝脏Th17细胞，结果显示，模型组肝内Th17细胞浸润明显增多，atRA治疗后显著减少，且肝脾Th17比例变化情况与肝组织病理学炎症评分具有较强的相关性。Treg、Th17细胞的体外诱导分化实验证实atRA可以促进Treg细胞的体外诱导分化，显著抑制Th17细胞的诱导分化，并呈浓度依赖性。RORγt和Foxp3分别是Th17和Treg细胞的特异性转录因子，它们的正常表达对Treg/Th17平衡的维持具有重要作用，研究表明，Foxp3/RORγt比值可以作为Treg/Th17平衡的功能指标，可以作为评估疾病活动的重要外周分子标志物。在本实验中，我们发现与正常对照组相比，AIH小鼠模型肝组织中RORγt的表达升高，而Foxp3的表达下降，Foxp3/RORγt比值下降，经过治疗后，atRA能够有效促进小鼠肝组织中Foxp3的表达，而显著降低RORγt的表达，Foxp3/RORγt比值回升，与模型组相比有显著性差异。由此说明，在S100蛋白诱导的AIH小鼠模型中，Treg/Th17 细胞平衡受到破坏，机体免疫耐受性丧失，不能够维持正常的免疫功能，通过重塑AIH小鼠体内Treg/Th17 细胞平衡进而减轻疾病严重程度可能是atRA治疗AIH 的机制之一。

在前期，TGF-β同时诱导Th17和Treg细胞的分化，当浓度较低的TGF-β与IL-6同时存在时，IL-6可通过激活STAT3的磷酸化表达驱动Th17细胞分化，进而诱导Th17特异性转录因子RORγt 及IL-17的表达。STAT3还通过下调TGF-β诱导的Foxp3表达抑制Treg细胞分化。为了探讨atRA能否对AIH小鼠中IL-6/STAT3信号通路起到调控作用，我们采用ELISA检测各组小鼠血清IL-6 含量，结果显示AIH模型组小鼠血清IL-6含量显著升高，而atRA可以抑制IL-6的增加，进一步检测了AIH小鼠肝组织中 IL-6 mRNA相对表达水平，结果与血清水平一致。同时发现AIH小鼠肝组织中STAT3在mRNA和蛋白水平上表达均有所上升，p-STAT3的表达明显增多，而atRA治疗组明显下降。

研究结论：本研究发现，atRA可抑制AIH小鼠 Th17 细胞的分化，增加 Treg 细胞的分化，从而通过调节AIH体内的Treg/Th17 细胞平衡改善肝脏炎症反应，且这种调节作用可能是通过调控IL-6/STAT3信号通路来实现的。总的来说，我们的研究结果证明了atRA作为一种免疫调节剂来预防和治疗AIH的潜在价值，能够为atRA治疗AIH 提供一定的理论依据。

2-11. 高盐调控Th9分化及其在S100诱导的小鼠自身免疫性肝炎中的作用

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）属于自身免疫性肝病的一种，是机体对肝细胞产生自身抗体及自身反应性T细胞致肝脏炎症性病变，如不及时治疗，最终会导致肝硬化和肝功能衰竭。目前普遍认为AIH 发病机制中免疫耐受性的破坏和免疫稳态的失衡可能是在允许的遗传结构背景下环境触发的结果。辅助T细胞（T helper, Th）9作为一个新的Th亚群，已被证实是介导多种自身免疫性疾病（autoimmune disease, AD）发生发展的关键介质。目前，大多数成年人每天摄入的食盐远高于WHO的推荐量。此前，高盐饮食（high salt diet, HSD）已被证实与多种AD的发展有关，尽管HSD通过促进Th细胞分化在多种AD模型中的作用已被广泛证实，尚不清楚它是否也通过Th9细胞和IL-9调控AIH的发生和发展。本研究旨在探讨HSD在AIH模型中的作用及其与Th9细胞的关系。

研究内容如下：

（1）如图1A所示，利用饮食干预（4%高盐饮食或普通饮食）及腹腔内注射新鲜制备的小鼠肝脏S100抗原建立4组小鼠模型，分别为对照/正常饮食（Control/ND）组，对照/高盐饮食（Control/HSD）组，模型/正常饮食（AIH/ND组）与模型/高盐饮食（AIH/HSD）组。通过小鼠一般情况观察、肝脾大体形态学及肝脾指数变化、肝脏组织病理染色及炎症评分、血清生化（Na+、Cl-、AST、ALT及ALB）分析等评估AIH炎症改变。

（2）采用CD4和IL-9免疫荧光共染方法检测小鼠肝脏组织中Th9细胞水平；分离小鼠脾脏单个核细胞，通过流式细胞术比较脾脏Th9细胞比例变化。

（3）Real time PCR检测小鼠肝脏组织中Il9 mRNA的表达；ELISA法检测小鼠肝匀浆中IL-9的表达水平。

（4）Real time PCR检测小鼠肝组织中Th9细胞特异性转录因子Irf4 mRNA的表达；Western blot检测小鼠肝组织中IRF4的蛋白半定量表达。

（5）体外实验验证高盐环境对Th9细胞特异性分化的影响。

研究结果如下：

（1）HSD加剧了S100诱导的小鼠AIH：接受HSD的小鼠在腹膜内注射 S-100抗原后出现更严重的自身免疫性炎症。动物实验结束时，AIH/ND组小鼠腹腔内有腹水出现，与AIH/ND组小鼠相比，AIH/HSD组小鼠体重明显降低（图1B），实验期间AIH/HSD组有3只小鼠发生死亡（图1C）。如图1D所示，分离小鼠肝脏和脾脏组织，与对照组相比，AIH/ND组小鼠的肝实质发生了显著变化，包括体积增加、硬度增加、颜色变深。肝脏表面有一些白色油腻物质，周围组织有明显粘连。这些表现在AIH/HSD组中更为明显。同样，AIH/HSD组的脾脏较AIH/ND组更肿大，与周围组织的粘连更重。AIH/HSD组肝指数、脾指数均显着高于AIH/ND组。组织病理学检查结果显示，AIH/ND组和AIH/HSD组门脉区和中央静脉附近有大量炎性细胞浸润，出现典型界面性肝炎的表现。此外，AIH/HSD组肝小叶和肝细胞索严重紊乱，肝门区和中央静脉附近肝细胞结构受损，部分肝实质和肝包膜呈脂肪变性（图1E）。AIH/HSD组小鼠的组织学评分显著高于AIH/ND组（图1F）。血清生化检测显示，摄入高盐后Na+增加，但Cl-没有明显变化（图1G）。HSD可以增加AIH模型小鼠中AST和ALT的活性（图1H）。总之，这些结果表明HSD加剧了AIH模型小鼠的肝脏炎症。

（2）HSD增强AIH小鼠Th9细胞分化和IL-9分泌：为了探究HSD对AIH小鼠Th9细胞分化的影响，我们采用免疫荧光技术检测肝组织中CD4和IL-9的表达，以检测Th9细胞在肝脏中的浸润情况。如图2A所示，与Control/ND组相比，AIH/ND小鼠的CD4+IL9+细胞个数增多，共染细胞在AIH/HSD小鼠中更高。流式细胞仪分析显示，在AIH/HSD组小鼠中发现脾细胞中CD4+IL-9+T细胞的比例最高（图2B）。IL-9的表达如图2C和2D所示。AIH/HSD组小鼠肝组织中IL-9 mRNA表达和IL-9分泌显着增强。结合以上结果，有理由认为HSD促进了AIH小鼠Th9细胞的分化，增强了IL-9的分泌。

（3）HSD调控AIH小鼠肝组织中IRF4的表达：IRF4作为特异的转录因子，在Th9的分化中起着至关重要的作用。因此，分别通过RT-PCR和蛋白质印迹分析测量了IRF4的表达。RT-PCR显示，与AIH/ND组小鼠相比，AIH/HSD组小鼠中Irf4的mRNA表达水平增高（图 3A）。蛋白质印迹分析在蛋白质水平上显示出相同的趋势（图 3B）。这些结果表明HSD增强了AIH中IRF4的表达，提示HSD可能通过上调IRF4的表达来促进Th9细胞的分化。

（4）从小鼠脾脏单个核细胞分选的初始T细胞纯度超过96%，当培养条件同时包含TGF-β和IL-4时，高盐（40mM NaCl）能够显著促进Th9细胞分化（图4A）；当培养条件仅包含TGF-β时，高盐（40mM NaCl）对Th9细胞分化无显著促进作用（图4B）；当培养条件仅包含IL-4时，高盐（40mM NaCl）对Th9细胞分化也无促进作用（图4C）。

研究结论：

（1）高盐饮食对于S100肝抗原诱导的小鼠自身免疫性肝炎具有促炎作用，这种作用可能与高盐上调IRF4的水平并激活了自身免疫性肝炎模型中Th9细胞的分化进而促进IL-9分泌有关，Th9细胞是高盐饮食加重自身免疫性肝炎的关键介质。

（2）高盐能在体外促进Th9细胞分化，且NaCl对Th9的促分化作用具有特异性。

图1 高盐饮食加重S100诱导的小鼠自身免疫性肝炎

A：自身免疫性肝炎模型建立示意图；B：实验期间各组小鼠体重变化；C：实验期间各组小鼠生存情况；D：各组小鼠肝脾大体观；E：各组小鼠肝脏组织HE染色（比例尺为50μm）；F：各组小鼠肝脏组织HE染色病理评分；G：各组小鼠血清Na+和Cl-水平； H：各组小鼠血清AST和ALT水平。

图2 高盐饮食增加自身免疫性肝炎小鼠Th9细胞分化和IL-9分泌

A：各组小鼠肝脏组织CD4和IL-9免疫荧光检测（比例尺为50μm）；B：各组小鼠脾脏Th9细胞流式检测；C：各组小鼠肝脏组织Il9 mRNA相对表达量；D：各组小鼠肝匀浆IL-9表达水平。

图3 高盐饮食上调自身免疫性肝炎小鼠肝组织中IRF4的表达

A：各组小鼠肝脏组织Irf4 mRNA相对表达水平；B：各组小鼠肝脏组织中转录因子IRF4的表达。

图4 高盐在体外促进Th9细胞分化

A：在正常或高盐条件下用TGF-β和IL-4诱导初始T细胞；B：在正常或高盐条件下仅用TGF-β诱导初始T细胞；C：在正常或高盐条件下仅用IL-4诱导初始T细胞。

2-12. LncRNA MIR4435-2HG通过调节miR-128-3p / ABHD17C轴促进胰腺癌进展的机制研究

胰腺癌 (Pancreatic cancer, PC）是消化系统恶性肿瘤相关死亡的第二大原因，严重威胁人民的生命和健康。lncRNA可以对内源性miRNA发挥海绵吸附功能，抑制miRNA的生物学功能，减少对相应靶基因翻译的抑制作用或对靶基因的降解作用，从而间接地调控肿瘤的进展。研究显示lncRNAMIR4435-2H、miR-128-3p以及miR-128-3p调控的靶基因在多种肿瘤的促癌过程中发挥着重要的作用。但MIR4435-2HG、miR-128-3p以及miR-128-3p调控的靶基因ABHD17C在胰腺癌发生和发展中的作用是未知的。

本研究的内容主要包括：（1）检测 lncRNA MIR4435-2HG、miR-128-3p 、ABHD17C，分析与胰腺癌的病理特征及生存率的关系。（2）lncRNA MIR4435-2HG、miR-128-3p、ABHD17C对胰腺癌细胞增殖，侵袭转移的影响。目前取得的主要结果如下展示。

图1 检测 lncRNA MIR4435-2HG、miR-128-3p 、ABHD17C，分析与胰腺癌的病理特征及生存率的关系。

图2 lncRNA MIR4435-2HG对胰腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭的影响。

图3 lncRNA MIR4435-2HG对miR-128-3p海绵吸附作用以及miR-128-3p对靶基因ABHD17C的靶向作用。

图4 lncRNA MIR4435-2HG对miR-128-3p海绵吸附作用以及miR-128-3p对靶基因ABHD17C的靶向作用。

图5 LncRNA MIR4435-2HG通过调节miR-128-3p/ABHD17C信号通路影响肿瘤细胞的增殖及侵袭转移。

目前实验进行了约40%，已有的所有的实验结果跟预期结果相符，即LncRNA MIR4435-2HG通过调节miR-128-3p / ABHD17C轴促进胰腺癌的进展。但此结论还需要更多的实验结果支撑。

2-13. 桦木酸通过介导miRNA-365调控IL-6/AKT/STAT3信号通路对胰腺癌的影响及其机制

胰腺癌（PC）是一种发病隐匿、进展迅速、恶性程度极高的消化道恶性肿瘤，90%的胰腺癌为起源于导管上皮的胰腺导管腺癌（PDAC），早期诊断和治疗都存在困难。桦木酸（betulinic acid，BA）是属于羽扇豆烷型五环三萜类的天然多功能小分子。既往研究证实，BA具有抗肿瘤、抗炎、抗血管生成、抗病毒和免疫调节等多种生物活性。最近一些研究证实，微小RNA（micro-RNAs，miRNAs）可能在BA抗肿瘤过程中扮演着极其重要的角色, 如BA可以通过上调miR-21来逆转p53和Sod2的表达从而抑制肝癌细胞的生长发育。

研究内容和方法如下：

（1）BA对PDAC细胞增殖、迁移和侵袭的影响

通过给与不同浓度BA，研究PDAC细胞增殖、迁移和侵袭的变化，探讨BA的抗肿瘤活性与剂量，并测定各组miRNA-365和IL-6的表达情况，初探相关作用机制。

（2）BA介导miRNA-365对PDAC细胞增殖、迁移和侵袭的影响

根据上述实验，过表达或者抑制PDAC中的miRNA-365，从而验证miRNA-365是否在BA发挥抗肿瘤作用中扮演关键角色，并通过研究下游IL-6/AKT/STAT3信号通路的变化，最终阐明BA发挥抗肿瘤作用的相关机制。

（3）动物实验验证

为了推进BA未来应用，提供更为详实的研究数据和真实的体内试验结果，对于胰腺癌模型大鼠给与BA灌胃后，观察胰腺肿瘤组织变化和相关信号通路变化，验证上述结论。

研究结果和讨论分析如下：

BA对胰腺癌细胞的影响在先前的研究中已被证明，并且于本实验的结果相一致。Figure 1中，我们可以看到BA以时间，浓度依赖方式抑制PANC-1细胞的增殖活力（图1A）。同样的，BA浓度的增加，细胞凋亡也随之增加。在浓度在30µM时，细胞凋亡超过了50%（图1B）。与0µM的相比较，10µM，20µM，30µM的BA显著的抑制了细胞的迁移能力(图1C)。

图1 (A) BA以浓度、时间为依赖性抑制细胞活力;(B) BA上调细胞凋亡;(C) BA降低了细胞侵袭能力。

根据先前实验结果分析， BA作用48h的IC50的浓度为27.57µM，因此，后续实验选择BA的作用条件为28µM。我们在实验中引入了miR365的抑制剂，以验证BA对miR365的调节作用是否与抑制剂的相似。结果如图所示，inhibitor显著的下调了miR365的水平，这与BA的作用相一致（图2A, 3B）。同时，BA与inhibitor对细胞增殖侵袭能力都具有抑制作用（图2C, 3D），两者的联合作用则进一步的减弱了癌细胞的增殖及侵袭能力。与上述结果一致，IL-6以及磷酸化的AKT、STAT3皆被下调（图2E, 3F）。

图2 (A) miR365抑制剂的作用;(B) RT-PCR检测BA和miR365抑制剂的效果;(C) MTT检测细胞活力;(D)细胞侵袭实验;(E) IL-6、AKT、STAT3 mRNA的表达;(F) IL-6、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3蛋白水平。

研究结论：细胞层面，BA通过介导miR365的水平调节IL-6的表达，并且通过IL-6/AKT/STAT3通路抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭转移，促进细胞凋亡。

2-14. MMP28影响胰腺癌中TAM高浸润的机制研究

胰腺癌（pancreatic cancer）是致死率极高的恶性肿瘤之一，主要特征是早期症状隐匿、易发生淋巴结远处转移、血管及神经侵犯、5年生存率差，并且对当前的治疗表现出不良反应等特点。即使采用手术切除，也难以避免肿瘤复发，虽然化疗一直是胰腺癌治疗的主要选择，但胰腺癌的标准化疗方案常常出现耐药性，使得治疗效果有限，增加了患者的死亡率。寻找新的治疗方法迫在眉睫。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）对胰腺癌的增殖、侵袭和转移起重要作用，针对TAM向胰腺癌组织的浸润的深入研究及靶向巨噬细胞的免疫治疗，或能解决胰腺癌治疗的难题。

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）在机体防御、损伤、炎症和修复中发挥广泛作用。近些年来研究发现 MMPs 在细胞凋亡、免疫、细胞迁移和血管生成等途径中发挥调节作用，能促进肿瘤的生长并引起肿瘤的侵袭、转移和免疫逃避，尤其是 MMP28，目前已经发现在结直肠癌、胃癌、肝癌中高表达，并与其预后密切相关。探究MMP28在胰腺癌中及TAM中发挥的作用及其机制为胰腺癌的靶向及免疫治疗提供新的方向。

研究内容和方法如下：

（1）筛选作用于胰腺癌中TAM 的相关因子

① 巨噬细胞浸润程度与胰腺癌临床病理特征的关系

根据临床要求的纳入及排除标准，收集临床胰腺癌及癌旁组织样本，进行巨噬细胞浸润情况鉴定。用Logistic 多因素回归分析分析巨噬细胞浸润程度与临床病理特征的关系。

② 筛选和验证作用于TAM及可能的作用机制

前期经过生物信息学推测出MMP28与TAM呈负相关关系，但并未得到验证，此外需要进一步研究出可能的作用机制。通过免疫组化分析MMP28表达水平与 TAM 浸润程度（CD68、CD163 阳性细胞的百分比）之间的关系，同时可以分析 MMP28表达水平或 TAM 浸润与胰腺癌患者预后的联系。

（2）分析MMP28与胰腺癌的增殖、侵袭和转移相关性

在临床样本的基础上，通过细胞实验如CCK8、transwell实验、划痕实验、流式细胞术等分析MMP28与胰腺癌发生发展之间的关系。

（3）分析MMP28如何影响TAM的浸润（巨噬细胞的募集）及可能的作用机制

MMP28影响巨噬细胞的募集：将胰腺癌细胞和巨噬细胞共培养，通过上调或下调MMP28的表达水平，除了重复检测步骤（2）的内容，此外需要观察TAM的形态变化，并通过transwell实验测得TAM的募集水平，qRT-PCR和WB技术检测CD68、CD163的表达水平。

图1 根据临床要求的纳入及排除标准，收集临床胰腺癌及癌旁组织样本，将其进行免疫组化分析其表达水平。（A：癌旁组织，B：癌组织）

图2 前期通过培养HPDE、PANC1、AsPC-1、BxPC-3和SW1990胰腺癌细胞系，并分别提取上述细胞系的RNA和蛋白，测定了MMP28在胰腺癌细胞中高表达。

图3 根据前期的工作基础，AsPC-1和BxPC-3胰腺癌细胞系作为研究对象，通过构建MMP28敲低慢病毒，将其转入上述细胞中，通过PCR验证敲低水平（蛋白水平正在验证），后期将进行功能试验（增殖、侵袭、细胞周期和凋亡）。

根据上述结果我们证实了MMP28在胰腺癌组织中高表达，并在体外利用PCR和WB技术同样证实了MMP28在胰腺癌细胞中的高表达，之后我们通过构建MMP28敲低慢病毒将其转染AsPC-1和BxPC-3两株胰腺癌细胞，通过PCR水平验证其敲低，后期将进行功能试验验证进一步完善结果。

2-15. 抗沉默组蛋白1B（ASF1B）与胰腺癌临床预后和增殖侵袭的关系

胰腺癌是一种高致命性疾病，预后较差，死亡率接近其发病率。胰腺癌的全球负担在过去几十年中急剧增加，预计它将持续是癌症导致相关死亡的主要原因：在全世界人类范围内，年龄标准化发病率从1990年的5.0 / 10万人年上升到2017年的5.7(5.6-5.8)/ 10万人年。ASF1是高度保守的组蛋白分子伴侣，介导组蛋白转移，是DNA的开关，促进组蛋白H3上赖氨酸的乙酰化。ASF1B耗竭即可导致异常核结构数量的显着和可再生的增加，包括改变的核形态（比对照siRNA的3-10倍）和在所有研究的细胞系中的微核形成以及核桥的形成。

迄今为止，尚未有学者发表相关文献报道ASF1B与胰腺癌之间具体的体内实验和体外实验的方法、过程和结果。为了验证之前的这些推测，我们进行了一些体外实验，在细胞层面研究ASF1B mRNA表达与胰腺癌增殖的关系。本研究拟通过qRT-PCR 检测ASF1B在胰腺癌细胞系中 mRNA 水平表达情况，选取胰腺癌细胞株中表达ASF1B mRNA水平最高的SW1990细胞进行后续细胞实验，然后将SW1990细胞经过慢病毒转染敲低后再次检测ASF1B的表达，进一步通过细胞增殖-毒性实验、细胞划痕实验检测下调ASF1B对SW1990细胞增殖的影响。

图1 **: P<0.01，***: P<0.001，与HPNE细胞比较，ASF1B mRNA在人胰腺上皮细胞和四种胰腺癌细胞系中的表达水平。

由图1可见，通过实时定量PCR检测胰腺细胞系中HPNE、AsPC-1、BxPC-3、SW1990、PANC-1 细胞中ASF1B mRNA 相对表达量的结果分别为：1.001±0.032 、2.799 ± 0.019 、1.363 ± 0.031 、5.554±0.021、2.553 ± 0.032 。AsPC-1、BxPC-3、SW1990、PANC-1细胞组中ASF1B mRNA表达量，与 HPNE 细胞组中的表达量相比，结果显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中以SW1990细胞中ASF1B表达量最高，故选择SW1990细胞进行后续实验。

图2 ASF1B 通过慢病毒转染SW1900细胞后发出荧光。

图3 **: P<0.01，***: P<0.001，与Negative control细胞比较，ASF1B 在SW1990细胞中敲低效率的验证。

SW1990细胞经过慢病毒转染实验、含3μg/ml嘌呤霉素浓度的完全培养基培养一段时间并获得稳定转染细胞株后，利用荧光显微镜在暗室中拍摄图片（如图2所示），可见细胞内布满绿色荧光，证明转染成功。采用 qRT-PCR 检测SW1990细胞中 ASF1B mRNA发现，正常对照组（0.982±0.021 ）和阴性病毒对照组（1.0001±0.012 ）相比，ASF1B mRNA 表达水平差异没有统计学意义（P＞0.05）；与阴性对照组相比，在mRNA水平上，ASF1B-sh1 组（ 0.572±0.018 ）和 ASF1B-sh2 组（0.251±0.020 ）中ASF1B mRNA 表达水平均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05；P<0.05），见图3。

研究结论：ASF1B在胰腺癌组织和细胞中的表达较高，在正常胰腺组织和正常胰腺上皮细胞中的表达较低，它在胰腺癌的诊治、疗效判断和预后中具有一定的意义。

2-16. EMP1基因沉默对胰腺癌细胞生物学的影响及其机制研究

胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)是一种高致死率的恶性肿瘤，是美国癌症相关死亡的第四大原因，是中国癌症相关死亡的第六大原因，近年来胰腺癌发病率逐年升高,据上海市疾病预防控制中心统计,2006年达12.17/10万。到2030年,胰腺癌或将成为所有恶性肿瘤中的第2位致死原因。目前手术切除仍是最有效的治疗方法，然而，由于胰腺癌早期无明显症状，故在诊断时，大约80%-85%的患者已经发展到无法切除或转移的状况,从而导致较低的生存率，即使行手术治疗的患者，其预后仍然很差。因此，需要进一步探索胰腺癌发生的生物学机制和分子机制，为胰腺癌的综合治疗寻找新的策略。

项目组前期研究发现，胰腺癌细胞系（PANC-1, BxPC-3, , AsPC1）EMP1 明显高于人胰腺正常导管上皮细胞系(HPDE)。从GEO数据库中检索胰腺癌数据集，通过R语言对EMP1基因的表达进行可视化处理，分析了EMP1在胰腺癌和正常组织的表达水平及EMP1与胰腺癌患者预后的关系，分析出下游信号通路（PI3/AKT）并通过慢病毒转染胰腺癌细胞系（AsPC1，BxPC-3）进行验证。我们推测：EMP1通过介导PI3/AKT通路促进胰腺癌进展，沉默可抑制癌症进展。

研究内容和方法如下：

（1）EMP1在胰腺癌癌细胞系中的表达、鉴定

项目组已保存有以下实验所用胰腺癌及胰腺细胞系：PANC-1, BxPC-3, , AsPC1和人永生化正常胰腺细胞株 HPDE。分别利用 qRT-PCR、蛋白质印迹（Western Biot,WB）及免疫组化检测胰腺癌细胞PANC-1, BxPC-3, , AsPC1及组织和胰腺细胞HPDE及癌旁组织中EMP1 RNA及蛋白水平的表达。

（2）EMP1慢病毒的构建、验证

EMP1慢病毒的构建：设计合成EMP1敲低及 sh-NC 阴性对照序列（由上海吉凯生物科技有限责任公司设计完成），并转染AsPC1，BxPC-3 细胞进行验证，通过qRT-PCR检测EMP1敲低效率达到70%以上（正在进行）。

（3）EMP1对胰腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭的影响

AsPC1，BxPC-3细胞分别转染EMP1慢病毒，下调EMP1的表达；利用 CCK8、细胞克隆实验检测细胞增殖能力；利用流式细胞术检测细胞凋亡；利用 Transwell 法、划痕愈合实验分别检测细胞的侵袭及迁移能力。

（4）EMP1通过调节PI3/AKT信号通路影响癌症进展

AsPC1，BxPC-3细胞分别转染EMP1慢病毒，下调EMP1的表达；通过WB检测转染组和阴性对照组中PI3/AKT信号通路的表达情况。

（5）统计学分析

定量资料若服从正态分布采用均数±标准差描述，组间比较 t 检验，若不服从正态分布，则采用中位数和四分位数间距描述，组间比较采用 Wilcoxon 秩和检验；定性资料采用例数和构成比描述，组间比较采用卡方检验或者 Fisher确切概率法；Kaplan-Meier 法用于绘制生存曲线，组间比较采用 Log-rank 检验，多因素分析采用 Cox 比例风险回归模型。p<0.05 为差异有统计学意义。

研究结果和讨论分析：

生物信息学数据分析显示：EMP1在胰腺癌中高表达，并与预后相关（图1A、B），并且预测出EMP1下游信号通路（图1C）。

此后的研究内容包括：（1）胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型的影响进行细胞实验。构建EMP1敲低体系。通过基因干扰技术调节EMP1的表达，细胞系（两株）水平研究EMP1对人胰腺癌细胞的生物学特性的影响，从细胞增殖速度，细胞周期，细胞凋亡情况，克隆形成，细胞迁移能力等方面研究EMP1具有促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的生物学功能。（2）验证EMP1通过调节PI3/AKT轴促进胰腺癌进展的分子机制。

图1 生物信息学数据分析显示：EMP1在胰腺癌中高表达，并与预后相关（图1A、B），并且预测出EMP1下游信号通路（图1C）。

研究结论：EMP1在胰腺癌细胞中高表达，并通过PI3K-AKT信号通路影响细胞增殖、迁移、侵袭。

研究方向三：消化系统早癌筛查及早诊早治平台建设

3-1. 消化系肿瘤筛查及早诊早治质量控制与MDT远程智慧共享平台的构建

甘肃省胃癌发病率显著高于全国水平，2013年全省肿瘤登记地区的胃癌和食管癌发病率分别为62.37/10万和24.05/10万，居全省恶性肿瘤发病率的第一位和第三位，胃癌和食管癌死亡率分别为46.27/10万和21.40/10万，居全省恶性肿瘤死亡率的第一位和第三位。胃癌预后和临床进展密切相关，大部分早期胃癌在内镜下可获得根治性治疗，5年生存率可达到90%以上，进展期胃癌则低于20%。因此，本研究将首先在全省建立“消化系肿瘤筛查及早诊早治质量控制与MDT远程智慧共享平台”，在此平台的基础上实施甘肃省上消化道早癌筛查项目，最终以提高县市级医院内镜医生的诊断水平，进而提高上消化道早癌的早诊率和上消化道肿瘤患者生存率为目的。

2021年，本课题组在兰州市榆中县、东乡县、庆城县和临潭县四个地区开展了筛查项目，每个项目点均进行手把手内镜培训、上消化道早癌和病理知识讲座。

通过研发先进的5G互联网技术、大数据云计算技术、消化内镜影像人工智能技术，将其应用于消化系统癌症的筛查、早诊早治和质量控制过程中，建立国内先进的5G+人工智能辅助诊断+消化系统早癌筛查+肿瘤早诊早治+质量控制示范平台。开展智能医学影像识别、病理分型和多学科会诊以及多种医疗健康场景下的智能语音技术应用，为远程医疗提供功能强大、集成度高、简便易用的信息化、智能化平台。全方位加强消化道肿瘤诊治技术培训，并对原始数字图像进行建模与训练。项目团队先后遵循国际、国内术语集标准建立了甘肃省内镜诊疗领域内消化道结构化描述模板；加强了对县级医院进行消化内镜检查、治疗、清洗、消毒等全过程质量控制，进一步规范了基层医护人员操作流程；实现了人工智能动态识别/静态识别早期消化道病变的部位、性质；通过建设甘肃省早癌筛查质控平台，加强了早癌筛查过程中的大数据填报量，目前早癌筛查质控平台目前已链接市县级18家医院，截止目前18家医院早癌质控数据已经从3月26日开始系统同步上传。

3-2. 启动全国多中心研究12种微小核糖核酸（microRNA）检测试剂盒（荧光RT-PCR法）

胃癌目前的内镜检查等诊断方法消耗大量的人力、物力，且由于其是侵入性检查，很多无症状、低胃癌发病风险的患者难以接受。常规血清肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA），糖类抗原19-9（CA19-9），糖类抗原72-4（CA72-4）和糖类抗原50（CA50）等经常被用于胃肠道肿瘤辅助检测，但各类标志物的对于胃癌尤其是早期胃癌的灵敏度和特异度都不太理想，对胃癌的早期诊疗的价值有限。PG、HP以及G17也有一定的局限性。miRNA的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式。这些特点使得miRNA有可能成为肿瘤诊断新的生物学标记和治疗靶标。本研究验证杭州觅因生物科技有限公司生产的12种微小核糖核酸检测试剂盒在中国的应用，通过与金标准胃镜和/或病理检查结果验证该试剂盒检测胃癌及胃部瘤变的准确性。通过与已上市的PG I、PG II检测试剂进行比对试验，验证该试剂盒检测胃癌及胃部癌前病变的优效性。通过与已上市的HP、G17的检测试剂进行一致性分析。

本研究由兰州大学第一医院作为组长单位，联合中国医科大学附属盛京医院、吉林大学白求恩第一医院、山东大学齐鲁医院、浙江大学医学院附属杭州市第一医院、浙江大学医学院附属邵逸夫医院、华中科技大学同济医学院附属协和医院、南方医科大学南方医院，共8家中心一起开展，计划招募10000例受试者。2021年8月和12月召开了两次项目研讨会，该项目在兰州大学第一医院已通过伦理审批，并获人类遗传资源批件，截止2022年3月，已入组108例。

3-3. 启动cfRNA/cfDNA多生物标志物预测胃癌发病和预后风险、以及癌前病变发病和进展风险的前瞻性队列研究

本研究试图寻找胃癌、癌前病变与对照组中表达不同的miRNA及其他类型（流行病学高危因素、血清学蛋白标志物、cfRNA/cfDNA等）生物标志物，并长期随访探索其在预测胃癌发生风险的效能。同时验证已发表的用于预测胃癌发病风险的12种miRNA组合在中国人群中的性能表现。本研究计划在兰州大学第一医院招募受试者4000例，40至69岁人群中做了内镜和（或）病理检查的人，满足纳入和排除标准后，进入胃癌、癌前病变和对照组。开展流行病学调查、血清学检查（HP抗体、PGI、PGII、G17、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA242和AFP）和核酸检测（miRNA、cfRNA、cfDNA），探索在胃癌、癌前病变和对照等三个人群中表达不同的生物标志物。截止2022年3月，目前已入组157例。

3-4. 甘肃省重大疾病临床及生物信息资源库

已建立可收集2万例数据信息、20 万份样本资源的生物信息资源平台，拥有国内领先、完备的样本保存设备，包括：冻存管理软件、温度监控管理系统、无线数据采集模块、实验室低温标签制作套装、大容量气相液氮罐，超低温冰箱，低温操作台等。已建立齐全的样本库实践规范，包括：生物标本采集技术规范及数据库建立指南、标准化样本操作过程。目前工作人员有四位，两位于在复旦大学肿瘤医院组织库进行为期一周的培训学习，掌握了标本的采集、处理、存储和出库等过程。有1位工作人员于2021年参加了中国医药生物技术协会组织生物样本库分会开展的《生物样本库岗前培训》课程学习，并拿到合格证书。

目前存储的样本达5万份左右，其中甘肃省上消化道早癌筛查项目收集的标本有1.8万份左右。普外科日常手术和住院检查的组织标本和血液标本有1.5万份左右，白银地区东大沟镉污染暴露的人群队列收集的标本有1万份左右，肺癌和结直肠癌筛查多中心随机对照研究收集的标本有0.8万份左右。

二、队伍建设和人才培养

实验室现有固定工作人员22名，具有博士学位者5人，博士硕士研究生导师1人，硕士研究生导师4人。2021年度毕业博士2名，毕业硕士18名。目前正在实验室开展实验的普外专业、肿瘤学专业以及其他专业的研究生共60人。

重点实验室现有国家卫生计生突出贡献中青年专家1人，教育部“新世纪优秀人才”1人，甘肃省拔尖领军人才1人，甘肃省领军人才3人，陇原青年创新人才3人，甘肃省卫生厅领军人才1人，甘肃省医疗卫生中青年学术技术带头人2名，中国医师协会内镜医师分会副会长1人，中国医师协会内镜医师分会内镜诊疗质量管理与控制专业委员会主任委员1人，委员1人，中华医学会消化内镜学分会常务委员1人，中国医师协会胰腺病学专业委员会主任委员1人，中国医师协会外科医师分会包虫病外科专业委员会副主任委员1人，委员2人、中国医药生物技术协会常务理事1人，中华医学会消化内镜学分会内镜外科学组委员1人，中国医药教育协会腹部肿瘤专业委员会常务委员1人，中国医师协会胆道外科医师委员会青年委员1人，中国医师协会胰腺病专业委员会胰腺癌学组委员1人，中国医师协会内镜医师分会消化内镜专业委员会常务委员1人，中关村（泛亚）消化内镜技术创新战略联盟副理事长1人，中国抗癌协会肝癌专业委员会委员1人，中国医药生物技术协会医药生物技术临床应用专业委员会常务委员1人、中华医学会肿瘤学分会肝癌学组委员1人，中国抗癌协会肝癌专业委员会委员1人，中国医师协会外科医师分会肥胖和糖尿病外科医师委员会委员1人，甘肃省医学会外科学专业委员会候任主任委员1人，甘肃省医学会消化内镜专业委员会副主任委员1人，甘肃省医学会创伤专业委员会副主任委员1人，甘肃省中西医专业委员会普外分会副会长1人，委员1人，国家卫计委《包虫病外科治疗救助项目》专家组成员1人，甘肃省医师协会普外医师分会副会长1人，常务理事2人，理事2人；甘肃医师协会普外医师分会微创外科医师委员会副主任委员1人，甘肃省医师协会普外医师分会胆道外科医师委员会委员1人，甘肃省中西医结合学会普外科分会委员1人，甘肃省地方病诊断专家组寄生虫病诊断小组组长1人、甘肃省包虫病防治项目外科治疗专家技术指导小组专家6人。

三、学术交流和开放流动

科室注重与国外及国内同行的交流与协作，已与世界卫生组织（WHO）国际癌症研究署（IARC）、美国“克里夫兰医学中心”消化系统疾病研究中心、美国阿肯色医科大学、宾西法尼亚大学、瑞典延雪萍大学、瑞典卡罗林斯卡医学院、澳大利亚悉尼大学、香港中文大学威尔斯亲王医院、日本京都第二红十字医院、日本顺天堂大学、东京女子医科大学、日本秋田大学、日本鸟取大、日本葛西昌医会医院等国际知名大学和医院形成长期、稳定的合作关系；与北京协和医院、北京大学人民医院、北京301医院、第二军医大学长海医院、首都医科大学附属北京友谊医院、四川大学华西医院、浙江大学第一、第二附属医院、上海中山医院、上海新华医院、天津市第一中心医院、中山大学第一、第三附属医院、华中科技学同济医院、第三军医大学西南医院、江苏省人民医院的专家建立了长期合作交流的伙伴关系。并且在医学形态学方面与兰州大学电镜中心建立科研合作、在细胞力学方面与兰州大学土木工程学院建立科研合作、在环境与肿瘤发生的关系方面与中国科学院寒区旱区研究所建立合作、在流行病学方面与兰州大学公共卫生学院、甘肃省医学科学院建立合作、在干细胞治疗良性病方面与国家干细胞库建立合作。同时，积极支持地县级医院的发展，为甘肃省医疗卫生事业发展作出较大贡献。

1. 兰大一院院长李汛教授入选第二批“甘肃省拔尖领军人才”

2021年8月，甘肃省委人才工作领导小组公布第二批甘肃省拔尖领军人才名单，兰州大学第一医院院长李汛教授入选第二批甘肃省拔尖领军人才。

2019年10月，甘肃省委办公厅甘肃省人民政府办公厅印发《甘肃省拔尖人才培养扶持办法(试行)》，计划从省领军人才中逐步遴选100名左右学术技术水平较高、业绩突出、具备良好发展潜力的拔尖领军人才，为加快建设幸福美好新甘肃、开创富民兴陇新局面提供高层次人才保障。2021年度开展第二批甘肃省拔尖领军人才选拔。

李汛教授是医学博士、博士后，一级主任医师，博士生导师，现任兰州大学第一医院院长及兰州大学第一医院医学前沿研究创新中心、肝胆胰外科研究所、甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室主任，擅长肝胆胰外科、内镜外科和器官移植。

李汛教授多年来致力于西部重大及高发消化系统肿瘤，尤其是肝胆胰系统复杂疾病的内镜微创综合诊疗模式的建立和推广、消化系统肿瘤早期筛查和早诊早治的基础与临床转化研究、干细胞及肿瘤免疫细胞治疗终末期肝病的基础与临床转化研究，主持及参与完成29项国家级和省、部级科研项目，主持国科金面上项目2项、地区基金项目1项，主持甘肃省科技重大专项2项。出版专著13部（含英文专著4部），发表SCI及国家级学术论文240余篇，获国家发明专利1件，获甘肃省科学技术进步奖一等奖2项、二等奖4项、三等奖3项。

李汛教授入选第二批甘肃省拔尖领军人才进一步加强了兰大一院高层次人才队伍建设，为医院人才培养和学科建设起到了积极的推动作用。

2. 2021年度甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室学术委员会会议暨重点实验室年会

2021年5月23日下午，兰州大学第一医院，甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室举办了2021年度甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室学术委员会会议暨重点实验室年会。会议邀请到了中国工程院董尔丹院士，甘肃省科技厅梁云升处长，陈录元主任，张其斌主任，中国食品药品检定研究院袁宝珠教授，刘冰教授，夏国宏教授等领导及专家。此次年会旨在加强学术交流，提升实验室人员科研和管理能力，并听取各位领导及专家关于实验室建设的宝贵建议。

年会报告环节，各位报告专家展示了精彩严谨的学术讲解，同时分享了对一些领域发展的观点。姚佳副研究员做了重点实验室工作报告，袁宝珠教授介绍了“临床研究”用间充质干细胞质量评价标准，夏国宏教授介绍了干细胞相关产品的审批程序，刘冰教授介绍了干细胞外泌体研究进展，蔡文青博士做了题目为“The role of chromatin in cell differentiation”的报告，唐建明主任医师做了题目为“肝癌衍生生长因子HDGF通过激活STAT3信号通路驱动乳腺癌放疗抵抗”的报告，张世炳编辑做了题目为“期刊扩大影响力的新模式和新理念：以JCTH为例”的报告。

专家报告的间隙，与会代表和在校学子纷纷提出了自己的见解与疑惑，各位专家也颇为享受这种面对面的互动，不仅分享了个人的看法，同时详细地解答了提出的问题。

学术委员会主任董尔丹院士做了会议总结：首先与各位专家共同探讨了重点实验室未来规划的方向并提出了宝贵的建设性意见；总结中同时肯定了过去几年当中重点实验室的发展，包括科研队伍的壮大，管理的完善以及科研产量的增长。董尔丹院士进一步强调了从长远的眼光去建设重点实验室：其中高端人才的引进，尤其医学、生命科学、化学、物理等学科人才的引进是实验室未来发展的重要部分；与此同时，现有工作人员的培养同样须在将来起到提升实验室水平的作用。

年会在总结讨论声中圆满落下帷幕，重点实验室主任、学术委员会副主任李汛教授再一次表达了对董尔丹院士以及与会各位领导专家的感谢，同时对下一年的重点实验室年会的充满期待。

3. 姚佳副研究员荣获欧美同学会第二届“双创”大赛一等奖

12月19日下午，欧美同学会第二届“双创”大赛生物医药和中医药产业赛区颁奖仪式在兰州举行，兰州大学第一医院姚佳副研究员参赛项目“脐带间充质干细胞来源生长因子生发凝胶”荣获该赛事创意组第一名，甘肃省副省长张世珍亲自为其颁发了获奖证书。

欧美同学会第二届“双创”大赛是由欧美同学会（中国留学人员联谊会）主办，省委统战部、兰州市委统战部、甘肃欧美同学会、兰州欧美同学会、兰州高新区承办，自五月大赛启动以来，生物医药和中医药产业赛区共有来自全国各地的196个团队报名参与，整个赛事包括了报名、海选、初赛、产业决赛和全国总决赛五个阶段，经过激烈的竞争角逐，最终有6名参赛选手获得了该赛事的一等奖。

4. 李汛教授、朱晓亮主任指导的“早癌筛查试剂盒”项目荣获全国金奖

10月，由教育部等12个中央部委和江西省人民政府共同主办的国家级A+类赛事第七届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛总决赛在南昌大学举行。兰州大学第一临床医学院参赛项目“用心，为癌升温”miRNAs早期胃癌筛查试剂盒”荣获全国金奖，实现兰州大学以及甘肃省高教主赛道夺金“零的突破”。指导老师兰大一院院长李汛教授、朱晓亮主任获国家级优秀创新创业导师奖。

荣获全国金奖的“用心，为癌升温”miRNAs早期胃癌筛查试剂盒”项目基于当前我国胃癌高发但早期检出率低，有90%的患者入院治疗已经是中晚期，开展胃癌早筛迫在眉睫的现实问题作为研究依据，制作miRNAs早期胃癌筛查试剂盒，是中国首个、也是目前唯一一个早期胃癌miRNA筛查试剂盒。

5. 中国顶级消化内镜专家“云端论剑”——兰州大学第一医院成功举办2021年全国内镜外科学术会议

为加强我国消化系统疾病诊疗技术及策略的规范化、推动我国西部地区消化系统疾病多学科综合诊疗技术的发展，由北京医学奖励基金会、中华医学会消化内镜分会内镜外科学组主办，亚太ERCP联盟（APEC）、中国外科内镜青年医师俱乐部协办，兰州大学第一医院承办的“2021年全国内镜外科学术会议、2021年中华医学会消化内镜学分会内镜外科学组年会暨第16届中国西部治疗内镜与微创外科高峰论坛”8月13日上午在兰州大学第一医院隆重开幕。

受新冠疫情影响，此次会议采取“网络在线”形式召开，中国工程院院士、中国医师协会内镜医师分会会长、海军军医大学附属长海医院消化内科主任李兆申教授，沈阳军区总医院消化内科夏玉亭教授，中国医师协会常务理事、世界华人消化医师协会会长、首都医科大学附属北京友谊医院院长张澍田教授，中华医学会消化内镜学分会主任委员、中国医师协会内镜分会副会长、解放军总医院第一医学中心消化科主任令狐恩强教授，中华医学会消化内镜学分会候任主任委员、海军军医大学附属长海医院消化内科执行主任金震东教授、中华医学会消化内镜学分会副主任委员、北京医学会消化内镜学分会侯任主任委员、北京协和医院消化科主任杨爱明教授，中华医学会消化内镜学分会副主任委员、中国医师协会消化医师分会副会长、中国医科大学附属盛京医院院长孙思予教授，中华医学会消化内镜学分会副主任委员、南京大学医学院附属鼓楼医院消化科主任邹晓平教授，中华医学会消化内镜学分会副主任委员，复旦大学附属中山医院内镜中心主任周平红教授，原中华医学会杂志社社长、中国期刊协会副会长游苏宁教授，兰州大学副校长李玉民教授，中华医学会消化内镜学分会常务委员兼内镜外科学组组长、中国医师协会内镜医师分会副会长、中国医师协会胰腺病专业委员会主任委员、兰州大学第一医院院长李汛教授以及中华医学会消化内镜学分会各位代表及全国普外、肝胆、消化及消化内镜领域的专家及学者通过网络在线参会。

兰州大学第一医院院长李汛致欢迎辞表示，近年来，内镜微创技术的发展对消化系统疾病的诊断和治疗起到了革命性的推动作用，内镜技术已达到“无孔不入、无孔造孔而入”的境界，使内镜医师能在无创或微创的条件下进行诊断与治疗。治疗内镜“多样化”、治疗适应症“扩大化”已成为当前消化内镜的发展趋势。

本次盛会聚焦肝胆胰/胃肠等消化疾病，在诊治理念、微创诊治新技术、精准治疗及多学科综合诊疗等多个领域开展学术碰撞，组织全国的优秀医师团队开展“永无止镜”肝胆胰胃肠疾病内外科青年医师联合论坛及青年医师俱乐部学术研讨会，这将是一场汇聚国内消化系统疾病微创诊疗领域顶级学者的学术大餐和国内消化病内外科医师及青年学者的交流盛宴，也将有效促进疾病诊治的规范化，不断完善知识更新、技术创新及人才培养机制。

兰州大学第一医院普外科于1989年在西北地区开展了首例ERCP，并组建了一支由外科医生组成的内镜微创诊疗团队，至今已有32年、完成2万余例的ERCP诊疗，从开始的诊断为主，到现在治疗性ERCP占到所有病例的95%以上，也见证了中国ERCP诊疗技术的发展壮大。随着设备的更新及技术的发展，消化内镜不仅用于疾病的诊断，更多的是在疾病治疗方面发挥着重要作用。近年来，兰大一院外科内镜中心发展突飞猛进，在临床诊疗、新理念新技术革新、技术人才规范化培训等方面做出了突出成绩，比如采用多镜联合技术实现复杂胆系结石的“一站式”治疗、采用SpyGlass联合激光碎石治疗Mirizzi综合征、建立现代化的一体化复合手术室2间，引进第4代达芬奇机器人，助力肿瘤精准手术。

6. 兰州大学第五期学科交叉论坛——生命-医学交叉论坛在兰大一院举办

5月22日，兰州大学第五期学科交叉论坛——“第一届兰州大学生命-医学交叉论坛”在兰州大学第一医院举办。中国科学院院士刘维民出席论坛并担任论坛主席。兰州大学校长助理许鹏飞教授，论坛副主席兰州大学第一医院院长李汛教授、中国科学院生物物理研究所薛愿超教授出席论坛。来自中山大学、四川大学、中国科学院、海洋科学与技术国家实验室、中山大学第五医院等众多高校、科研院所、医疗机构的三百余位专家学者和师生参加论坛。

论坛围绕生物医学转化领域在基础研究、临床应用和产业发展等方面的最新进展与热点问题，探讨生命医学融合发展并服务于社会，邀请国内生物医学转化领域12位知名专家和青年学者做了精彩的学术报告。与会专家、学者和师生们进行了热烈的讨论交流。

论坛由兰州大学第一医院、兰州大学生命科学学院、甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室、兰州大学科学技术发展研究院承办。论坛的成功举办将为生物医学转化领域重大原始创新和关键核心技术突破提供新思路、新路径。

四、运行管理

实验室运行管理突出强调培养科研人员的责任感、调动科研人员的创新积极性，使每个科研人员个人价值的实现与实验室的发展、医院的提升、学校的进步以及国家的需求相联系，营造激发创新的氛围。在具体管理办法上，引导出良好的科研条件、发展空间、宽松灵活和谐的氛围、协调合作的人际关系。

实验室管理体制实行依托单位兰州大学第一医院所领导下的主任负责制，实验室是具有人、财、物自主管理权限、相对独立的研究实体。实验室制定了《生物治疗与再生医学重点实验室管理办法》、《生物治疗与再生医学重点实验室安全事故应急预案》，实现了科研仪器预约过程、研究生入科流程、实验人员的科研实验管理、科研环境卫生管理以及突发情况应急处理过程的规范化运行。

实验室聘请海内外生物治疗和再生医学方面的专家学者组成学术委员会。学术委员会是实验室的学术咨询机构，负责对实验室的学术方向、研究计划、主要学术骨干的选聘及国际学术交流活动提供咨询和建议。

实验室重视院内、省内、国内及国际间科研团队的交流与合作，在发展规划、课题评估和科研进展等方面进行多次研讨交流。实验室人员管理、科研进展、生物安全、设备购置和维护、耗材购置和分发、日常运行工作等严格依据省重点实验室日常运转管理规章制度进行。目前科研项目有序进行，科研成果达到目标，各类仪器设备运转良好，人员和谐共处。

五、科普和大型仪器设备开放共享情况

实验室为兰州大学第一医院、兰州大学第二医院以及兰州大学相关学院，包括第一临床医学院、第二临床医学院、护理学院、基础医学院、公共卫生学院、口腔医学院、生命科学学院等提供共享科研平台，同时接纳甘肃省内特别是兰州市高等院校和医疗机构的学生和教职员工的科研工作，并与国内先进实验室进行交流合作和仪器共享。内容涵盖细胞生物学、分子生物学、医学免疫学、流行病学与统计学、生物信息学、医学生物物理、化学和管理学科的等交叉学科的科学研究工作。

实验室定期会对入科的人员进行培训，2021年共举行培训16场。

附：2021年实验室举行的入科培训

次数	培训时间	培训内容
1	2021.4.22	贝克曼流式细胞应用交流会
2	2021.5.6	小分子化合物及化合物库在医学科研中的应用
3	2021.5.28	显微镜实验操作培训
4	2021.6.2	BD流式细胞仪操作培训和答疑；多组学在生物医学领域的应用和研究思路解析
5	2021.6.16	电子压片成像仪试用样机操作使用培训
6	2021.6.23	生物体内组织微环境、组织流式细胞定量分析技术
7	2021.6.30	倒置荧光显微镜操作使用培训
8	2021.7.9	安捷伦流式细胞仪操作使用培训
9	2021.7.16	伯乐CFX96型PCR仪操作使用培训
10	2021.7.29	显微图像的后期处理分析
11	2021.8.4	定量Western Blot精准数据完整解决方案
12	2021.10.15	安捷伦MX3000P、伯乐PCR仪、反转录仪、酶标仪、核酸蛋白分析仪、离心机、凝胶成像仪培训
13	2021.11.29	活细胞成像仪操作使用培训
14	2021.12.9	动态实时高分辨小动物光学成像仪操作使用培训
15	2021.12.21	密闭式流式分选仪操作使用培训
16	2021.12.31	密闭式流式分选仪、磁分选仪、组织处理器操作使用培训

附：实验室主要仪器：

仪器设备名称	厂家	型号	数量	单价（元）	购置年份	运行情况
全自动磁性细胞分选仪	德国美天旎	Auto-MACS-PRO	1	1442000	2019	良好
全自动可加热组织处理器	德国美天旎	autoMACS pro	1	480000	2019	良好
密闭式流式分选仪	德国美天旎	MACSQuant Tyto	1	3450000	2021	良好
Cytation ^TM 1 imaging reader	BioTek	cytation 1	1	483000	2019	良好
Cytation ^TM 2 imaging reader升级	BioTek	cytation 1	1	350000	2021	良好
ABI荧光定量PCR仪	ABI	ABI7500	1	86000	2019	良好
实时荧光定量PCR仪	ABI	Quant studio ^TM 5 Real-Time PCR instrument （384-well block）	1	500000	2019	良好
荧光定量PCR仪	STRATAGENE	MX3000p	1	350000	2016	良好
梯度PCR仪	ABI	Veriti 96	2	1000	2013	良好
凝胶成像系统	FusionFx	vilber Lourmat	1	150000	2016	良好
超微量核酸蛋白检测仪	Thermo	Nanodrop 2000	1	128000	2013	良好
倒置显微镜	Leica	S40-SLIder	1	68000	2013	良好
倒置显微镜	OLYMPUS	CKX41	1	68000	2013	良好
倒置显微镜	COIC	XDS-1B	1	100000	2016	良好
倒置荧光显微镜	OLYMPUS	IX73	1	438000	2021	良好
倒置荧光显微镜	OLYMPUS	CKX41	1	293200	2013	良好
正置荧光显微镜	OLYMPUS	BX51	1	400000	2016	良好
体式荧光显微镜	Leica	MZ10F	1	326832	2013	良好
激光尘埃粒子计数器	苏净	Y09-550	1	68000	2013	良好
浮游空气尘菌采样器	苏净	FKC-1	1	15800	2013	良好
全自动细胞计数仪	Nexcelom	Mini	1	45000	2019	良好
全自动样品快速研磨仪	上海净信科技	Tissuelyser-48	1	48600	2013	良好
PH酸度计	Mettler toledo	FiveEasy plus	1	2950	2019	良好
电泳配套系统	BIO-RAD		1	32457	2019	良好
电泳配套系统（1个电泳仪，2个电泳槽，1个转膜槽）	BIO-RAD		1	10000		良好
小动物麻醉机	南京卡尔文	KW-MZJ	1	16000	2019	良好
小鼠尾注显像仪	南京卡尔文	KW-XXY	1	1700	2019	良好
Thermo体温维持仪	瑞沃德/中国	69020	1	9000	2019	良好
全波长酶标仪	Biotek	synergy H1	1	45000	2013	良好
半干转转膜仪	BIO-RAD	Trans-BlotR SD cell	1	15191	2013	良好
原位杂交仪	AOSHENG	TDH-500	1	27000	2013	良好
722s型分光光度计	Lonza	XB-ZK006	1	2800	2013	良好
超纯水仪	和泰	20L，18.2欧姆	1	17380	2021	良好
全自动雪花制冰机	雪科	RMS-40	2	10620	2013	良好
立式全温-振荡培养箱	知楚	ZOLY-180E	1	24000	2021	良好
负80度冰箱	海尔	DW-86L388J（2018）	1	45000	2021	良好
负80度冰箱	美菱		1	36000	2021	良好
负80度冰箱	中科美菱	DW-HL538	1	100000	2016	良好
负80度冰箱	Thermo	902	1	68000		良好
负80度冰箱	Thermo	EXF400860	3	100000		良好
负20度冰箱	海尔	DW-30L-278	3	12000	2019- 2020	良好
负20度冰箱	中科美菱	DW-YL270	1	15800		良好
医用4度冰箱	中科美菱	YC-968L	1	22300		良好
医用4度冰箱	中科美菱	YC-950L	1	22300		良好
医用4度冰箱	海尔	SC-316	3	6800		良好
医用4度冰箱	中科美菱	YC-300L	1	7800		良好
家用制冷冰箱	海尔	BCD-477WDPCU1	2	3490	2021	良好
家用冰箱（上4下负20）	西门子	BCD-254	2	2699		良好
家用冰箱（上4下负20）	西门子	BCD-279W（KG29NV220C）	1	2599		良好
家用冰箱（上4下负20）	美菱	BCD-258	1	2000		良好
家用冰箱（三开门）	海尔	BCD-215SE BB	1	3000		良好
医用低速离心机	湘仪	L550	1	11670	2020	良好
高速冷冻离心机	湘仪	H1650R	1	23330	2020	良好
离心机	Thermo	HERAEUS PICO17	1	10000		良好
普通高速离心机	Thermo	ST-40	2	128000		良好
高速冷冻离心机	Thermo	Heraeus FRES0017	1	10000		良好
高速冷冻离心机	thermo	STRATOS	1	128000		良好
离心机	湘仪	CTK-48	1	15600		良好
高速冷冻离心机	Beckman coulter	Allegra X-30R centrifuge	1	5000		良好
高速离心机	国华	YXJ-2	1	1820		良好
离心机	湖南星科	TGL-22LM-B	1	80000		良好
低速台式离心机	湘仪	TD24-WS	1	5000		良好
低速台式离心机	时代贝利	DT5-2	1	8036		良好
生物安全柜	Thermo	1300 series A2	6	78000		良好
生物安全柜	Heal Force	HF safe-1200LC	1	78000		良好
生物安全柜	海尔	HR40-ⅡA2	1	78000		良好
CO2培养箱	Thermo	3111水套式	7	58000		良好
超净台	苏净安泰（AIRTECH）	SW-DJ-1FD	2	8000		良好
电热恒温培养箱	精宏	DMP-9082	1	6000		良好
电热恒温鼓风干燥箱	精宏	大	1	3850		良好
电热恒温鼓风干燥箱	精宏	中	1	3850		良好
电热恒温水浴锅（三孔三温）	精宏	DK-8d	1	2580		良好
电热恒温水温箱	新苗	H-5WX-420B5	2	1000		良好
电热恒温培养箱	新苗	DNP-9052BS-Ⅲ	1	6000		良好
恒温振荡器	Crystal Incushaker^R	IS-RSDA	1	11000		良好
金属浴	Thermo Q	CHB-T2-A	1	7200		良好
加热磁力搅拌器	WIGGENS	WH220 plus	1	4680		良好

六、未来3-5年工作计划

1. 学科建设

加强基础与临床医学与兰州大学生物学、化学、信息学等学科的融合，使其成为西部高发病流行病学研究、病理病因学和诊断治疗的综合性研究基地，形成具有西部特色的新型医学学科平台。积极申请教育部或国家级重点实验室。

2. 培养拔尖创新人才

结合国家人才战略的实施，着重加强医学队伍建设，进一步加大引进人才尤其是国外高水平医学人才的力度，努力创造条件，形成一支西部一流、国内先进、国际上具有一定影响力的医学专家、学科领军人才和创新团队，形成高素质的医学创新型人才队伍。

3. 提升科学研究水平

以国家重大需求和国际科学研究前沿为目标，针对西部高发疾病发病机制开展工作，制定防止新策略，提高原始创新和转化医学水平，大力开展有重大影响的原始创新研究和工程应用研究。

力争获国家三大奖1项；

获国家发明专利或实用新型专利20-30项；

在SCI收录杂志发表论文100篇以上；出版学术专著1-2部；

获得国家研究项目20-30项。累积科研经费达到1000万元。

4. 着力推进成果转化

着力提高我校医学自主创新和成果转化能力、承接国家重大科研任务能力，产生若干有影响的原始创新研究、医学应用研究和生物医学工程研究成果，力争成为西部地区基础研究的主要基地和创新中心。

以生物技术转化医学中心为平台，大力推进西部高发疾病诊疗研究领域成果的向临床的转化，提升社会服务能力，提高西部地区广大人民群众的健康水平，促进社会经济发展。

注册并开展临床试验5-10项；提出行业标准1-2项。